ניתוח אסוציאציות רחב של הגנום של חוזק תגובת ההגנה שנוצרה על ידי MAMP ועמידות לכתם עלה יעד בסורגום

חומרים צמחיים ופתוגנים

אוכלוסיית מיפוי של עמותת סורגום הידועה בשם אוכלוסיית ההמרה של סורגום (SCP) סופקה על ידי ד"ר פט בראון מאוניברסיטת אילינוי (כיום ב-UC Davis).זה תואר בעבר והוא אוסף של קווים מגוונים שהומרו לחוסר רגישות פוטו-תקופות וקומה קטנה יותר כדי להקל על הצמיחה וההתפתחות של הצמחים בסביבות ארה"ב.510 קווים מאוכלוסיה זו שימשו במחקר זה, אם כי עקב נביטה גרועה ובעיות בקרת איכות אחרות, לא כל הקווים שימשו בניתוח של כל שלוש התכונות.בסופו של דבר נעשה שימוש בנתונים מ-345 שורות לניתוח תגובת הצ'יטין, 472 שורות לתגובת flg22, ו-456 לתגובת TLS.B. cookeiזן LSLP18 התקבל מד"ר ברט בלוהם מאוניברסיטת ארקנסו.

מדידת תגובת MAMP

שני MAMPs שונים שימשו במחקר זה flg22, (Genscript catalog # RP19986), וכיטין.צמחי סורגום גודלו בתוספות שהונחו על דירות מלאות באדמה (33% Sunshine Redi-Earth Pro Growing Mix) בחממה.הצמחים הושקו יום לפני איסוף הדגימה כדי למנוע תוספת לחות עלים ביום האיסוף.

הקווים חולקו באקראי ומטעמים לוגיסטיים נשתלו בקבוצות של 60 קווים.לכל שורה נשתלו שלושה 'עציצים' עם שני זרעים בכל שורה.מנות עוקבות נשתלו ברגע שהמנה הקודמת עברה עיבוד עד להערכה של כלל האוכלוסייה.שתי ריצות ניסוי נערכו עבור שני MAMPs עם גנוטיפים שחולקו מחדש באקראי בכל אחת משתי הריצות.

מבחני ROS בוצעו כמתואר קודם לכן.בקצרה, עבור כל שורה נשתלו שישה זרעים ב-3 עציצים שונים.מתוך השתילים שהתקבלו, נבחרו שלושה על סמך אחידות.לא נעשה שימוש בשתילים שנראו יוצאי דופן או שהיו גבוהים או נמוכים משמעותית מהרוב.ארבע דסקיות עלים בקוטר 3 מ"מ נכרתו מהחלק הרחב ביותר של העלה הרביעי של שלושה צמחי סורגום שונים בני 15 ימים.דיסק אחד לכל עלה משני צמחים ושתי דיסקים מצמח אחד, כאשר הדיסק השני הופך לבקרת המים (ראה להלן).הדיסקים הוצפו בנפרד על 50 μl H20 בצלחת שחורה עם 96 בארים, אטמו עם אטם אלומיניום כדי למנוע חשיפה לאור, ונשמרו בטמפרטורת החדר למשך הלילה.למחרת בבוקר נוצרה תמיסת תגובה באמצעות 2 מ"ג/מ"ל פרוב כימילומינסצנטי L-012 (Wako, קטלוג מס' 120-04891), 2 מ"ג/מ"ל פרוקסידאז חזרת (סוג VI-A, Sigma-Aldrich, קטלוג מס' P6782), ו 100 מ"ג/מ"ל Chitin או 2 מיקרומטר של Flg22.50 μl מתמיסת תגובה זו נוספה לשלוש מתוך ארבע הבארות.הבאר הרביעית הייתה בקרה מדומה, אליה נוספה תמיסת התגובה למעט ה-MAMP.ארבע בארות ריקות המכילות רק מים נכללו גם בכל צלחת.

לאחר הוספת תמיסת התגובה, הארה נמדדה באמצעות SynergyTM 2 multi-detection microplate reader (BioTek) כל 2 דקות למשך שעה.קורא הלוחות לוקח מדידות זוהר כל 2 דקות במהלך שעה זו.הסכום של כל 31 הקריאות חושב כדי לתת את הערך עבור כל באר.הערך המשוער לתגובת MAMP עבור כל גנוטיפ חושב כ-(ערך הארה ממוצע של שלוש בארות הניסוי - ערך הבאר המדומה) - פחות ערך הבאר הריק הממוצע.ערכי הבאר הריק היו באופן עקבי קרוב לאפס.

עלה דיסקים שלNicotiana benthamiana, קו סורגום אחד עם תגובה גבוהה (SC0003), וקו סורגום אחד עם תגובה נמוכה (PI 6069) נכללו גם הם כבקרות בכל צלחת 96 בארים למטרות בקרת איכות.

B. cookeiהכנת חיסון וחיסון

B. cookeiחיסון הוכן כמתואר קודם לכן.בקצרה, גרגירי סורגום הושרו במים למשך שלושה ימים, נשטפו, נגרפו לצלוחיות חרוטיות של 1 ליטר ונעשו באוטוקלאב למשך שעה ב-15psi ו-121 מעלות צלזיוס.לאחר מכן חוסנו הגרגירים בכ-5 מ"ל של תפטיר חרוך מתרבות טרייה שלB. cookeiLSLP18 מבודד ונשאר למשך שבועיים בטמפרטורת החדר, מנער את הצלוחיות כל 3 ימים.לאחר שבועיים, גרגירי סורגום נגועים בפטריות יובשו באוויר ולאחר מכן אוחסנו ב-4 מעלות צלזיוס עד לחיסון בשדה.אותו חיסון שימש במשך כל הניסוי ונעשה טרי מדי שנה.לצורך חיסון, הוכנסו 6-10 גרגירים נגועים במעגל של צמחי סורגום בני 4-5 שבועות.הנבגים שנוצרו מפטריות אלו יזמו זיהום בצמחי הסורגום הצעירים תוך שבוע.

הכנת זרעים

לפני השתילה בשדה זרעי סורגום טופל בתערובת קוטל פטריות, קוטל חרקים ומגן המכילה ~ 1% קוטל פטריות Spirato 480 FS, 4% קוטל פטריות Sebring 480 FS, 3% מגן זרעים Sorpro 940 ES.לאחר מכן יובשו הזרעים באוויר למשך 3 ימים מה שסיפק ציפוי דק של תערובת זו סביב הזרעים.המגן איפשר את השימוש בקוטל העשבים Dual Magnum כטיפול טרום הופעה.

הערכת התנגדות לכתמי עלה מטרה

ה-SCP נשתל בתחנה המרכזית לחקר הגידולים בקלייטון, צפון קרוליינה ב-14-15 ביוני 2017 וב-20 ביוני 2018 בתכנון בלוקים שלם אקראי עם שני שכפולים ניסיוניים בכל מקרה.ניסויים נשתלו בשורות בודדות של 1.8 מ' ברוחב שורות של 0.9 מ' תוך שימוש ב-10 זרעים לחלקה.שתי שורות גבול נשתלו סביב הפריפריה של כל ניסוי כדי למנוע השפעות קצה.הניסויים חוסנו ב-20 ביולי 2017 וב-20 ביולי 2018, אז היו צמחי הסורגום בשלב צמיחה 3. הדירוגים בוצעו בסולם אחד עד תשע, כאשר צמחים שלא הראו סימני מחלה קיבלו ציון תשע ומוחלט. צמחים מתים צוינו כאחד.שני דירוגים נלקחו בשנת 2017 וארבע קריאות בשנת 2018 החל שבועיים לאחר החיסון בכל שנה.sAUDPC (אזור מתוקנן תחת עקומת התקדמות המחלה) חושב כפי שתואר קודם לכן.