דמיינו את השפעת קוטלי חרקים על תפקוד והרכבה של תעלות TRP בחרקים.

חומרי הדברה ממלאים תפקיד קריטי בטיפול במחסור במזון עולמי ובמאבק במחלות אנושיות הנישאות על ידי וקטורים. עם זאת, הבעיה הגוברת של עמידות לחומרי הדברה דורשת בדחיפות גילוי של תרכובות חדשות המכוונות למטרות שאינן מנוצלות מספיק. תעלות פוטנציאל קולטן חולף של חרקים (TRPV) - ננז'ונג (נאן) ובלתי פעילות (Iav) - יכולות ליצור תעלות הטרולוגיות (נאן-איב) ולהתמקם באיברים מכנו-סנסוריים המתווכים גיאוטרופיזם, שמיעה ותפיסת פרופריוספציה בחרקים. חלק מהחומרים המזיקים, כמו אפידופירולידון (AP), מכוונים לנאן-איב באמצעות מנגנונים לא ידועים. AP יעיל כנגד חרקים חודרים-מציצים (המיפטרנים), ומונע אכילה על ידי שיבוש תפקוד הסיבים. AP יכול להיקשר רק לנאן, אך רק נאן-איב יכול לתקשר עם אגוניסטים, כולל ניקוטינאמיד אנדוגני (NAM), ובכך להציג פעילות תעלות. למרות הפוטנציאל של נאן-איב כמטרה לקוטל חרקים, מעט ידוע על הרכבת התעלות שלו, אתרי קישור רגולטוריים ורגולציה תלוית Ca2+, דבר המעכב פיתוח נוסף של קוטל חרקים. במחקר זה, נעשה שימוש במיקרוסקופ קריו-אלקטרונים כדי לקבוע את מבנה ה-Nan-Iav בחרקי המיפטרה במצב נטול ליגנד קלמודולין, כמו גם עם AP ו-NAM בגבול התחום הציטופלזמי החוזר של אנקירין (ARD). באופן מפתיע, מצאנו שחלבון ה-Nan עצמו יכול ליצור פנטמר, אשר מתייצב על ידי אינטראקציות ARD בתיווך AP. מחקר זה חושף אינטראקציות מולקולריות בין קוטלי חרקים ואגוניסטים לבין Nan-Iav, תוך הדגשת החשיבות של ARD בתפקוד והרכבת התעלות, ובחינת מנגנון ויסות Ca2+.
על רקע שינויי האקלים הגלובליים החמורים יותר ויותר, הידרדרות בביטחון התזונתי העולמי היא אחד האתגרים המרכזיים של המאה ה-21, עם השלכות מדורגות על החברה.^1,2דו"ח ארגון הבריאות העולמי "מצב הביטחון התזונתי והתזונה בעולם לשנת 2023" (SOFI) מעריך כי כ-2.33 מיליארד בני אדם ברחבי העולם סובלים מחוסר ביטחון תזונתי בינוני עד חמור, בעיה ארוכת שנים.^3,4למרבה הצער, על פי ההערכות, כ-20% עד 30% או יותר מיבולי היבולים אובדים מדי שנה עקב מזיקים ופתוגנים, וההתחממות הגלובלית צפויה להחריף את עמידות המזיקים ואת פגיעות הגידולים.^4,5,6,7,8פיתוח חומרי הדברה הוא קריטי לא רק כדי להגן על גידולים מפני מזיקים ולהפחית את התפשטות פתוגנים הנישאים על ידי וקטורים, אלא גם כדי להילחם במחלות אנושיות הנישאות על ידי וקטורים כמו קדחת דנגי, מלריה ומחלת צ'אגאס, שהן עמידות יותר ויותר לחומרי הדברה.^5,9,10,11
בין המטרות העיקריות של קוטלי חרקים נוירוטוקסיים, ערוץ TRPV ההטרוטטרמרי Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) מייצג סוג של מטרות קוטלי חרקים שהתגלו רק בעשור האחרון, כולל קוטלי חרקים זמינים מסחרית כגון אימידקלופריד ופיראקלוסטרובין.^12,13,14קוטל החרקים החצי-סינתטי אפידופירוליפן (AP) הוא מוצר שפותח ומסחור לאחרונה, שמרכיבו העיקרי הוא קוטל החרקים הפעיל Inscalis®, אשר נקשר ל-AP ברמת פעילות תת-נאנומולרית.¹⁵AP מפגין רעילות חריפה נמוכה למאביקים, חרקים מועילים ואורגניזמים אחרים שאינם מטרה, וכאשר משתמשים בו בהתאם להוראות התווית, הוא יכול להפחית את לחץ העמידות לקוטלי חרקים אחרים.^16,17,18נאן ו-Iav נפוצים באופן נרחב על פני מיני חרקים, מתבטאים יחד רק בנוירונים של קולטני מתיחה כורדיאליים של האנטנות והגפיים, והם קריטיים לשמיעה, תפיסת כוח משיכה ותפיסת פרופריוספציה.^{13,16,19,20,21,22}AP, אימידקלופריד ופיראקלוסטרובין מגרים את קומפלקס Nan-Iav באמצעות מנגנון ייחודי, ובסופו של דבר מעכבים את התמרת אותות פרופריוספטיבית.^13,16,23אצל חרקים מוצצים (המיפטרנים) כמו כנימות וכלי יער, אובדן הפרופריוספציה פוגע ביכולת האכילה שלהם, ובסופו של דבר מוביל למוות.^13,24מעניין לציין, ש-AP מפגין זיקה גבוהה לקומפלקס Nan-Iav ואפיניות נמוכה לנאן בלבד. קישור AP ל-Nan-Iav גורם לזרם חשמלי, אך קישור לנאן בלבד אינו מגרה את פעילות התעלה. Iav עצמו אינו נקשר ל-AP כלל.¹⁶ממצא זה מצביע על כך ש-Nan ו-Iav עשויים להיקשר וליצור קומפלקסים שונים של תעלות Nan-Iav (למשל, עם יחסים סטוכיומטריים שונים או סידורים שונים בתוך אותו יחס סטוכיומטרי) או ש-AP עשוי להיקשר לאתרים מרובים. יתר על כן, האגוניסט הטבעי ניקוטינאמיד (NAM) נקשר לדרוזופילה Nan-Iav בזיקה מיקרומולרית, ומציג השפעות דומות לאלו של כנימות (AP) במבחנה.^16,25ומעכבים את רביית הכנימות והאכילה שלהן, מה שמוביל בסופו של דבר למותן^25,26נתונים אלה מעלים שאלות רבות. לדוגמה, עדיין לא ברור כיצד נוצר ההטרודימר Nan-Iav, אילו אתרי קישור משמשים לוויסות מולקולות קטנות, וכיצד מולקולות קטנות אלה מווסתות את תפקוד התעלות על ידי דיכוי פרופריוספציה. יתר על כן, הסיבות לכך ש-Nan עצמו אינו פעיל ובעל זיקה נמוכה ל-AP, בעוד שההטרודימר Nan-Iav פעיל וקושר AP בזיקה גבוהה יותר, נותרות לא ברורות. לבסוף, מעט ידוע על הרגולציה התלויה ב-Ca2+ של תפקוד Nan-Iav וכיצד הוא משולב בתהליכי איתות עצביים.^13,21
במחקר זה, בשילוב מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים, אלקטרופיזיולוגיה וטכניקות קישור רדיו-ליגנדים, הבהרנו את הרכבת Nan-Iav ואת מנגנון קישורו לווסת מולקולות קטנות. יתר על כן, זיהינו קלמודולין (CaM) הקשור באופן קונסטיטוטיבי ל-Iav ולפנטמרים של Nan המיוצבים על ידי AP. תוצאות אלו מספקות תובנות חשובות לגבי ויסות יוני סידן בתעלות, הרכבת התעלות והגורמים הקובעים את זיקת קישור הליגנד. חשוב מכך, אישרנו כי ARD ממלא תפקיד מרכזי בתהליכים אלה. המחקר שלנו של תעלות חרקים שלמות הקשורות לחומרי הדברה חקלאיים רלוונטיים.^{27, 28, 29}פותח סיכויים לפיתוח תעשיית חומרי הדברה, משפר את היעילות והספציפיות של חומרי הדברה, ומאפשר יישום של תרכובות המכוונות TRPV על מינים אחרים כדי להתמודד עם ביטחון תזונתי עולמי ובהתפשטות מחלות הנישאות על ידי וקטורים.
כמו כן, מצאנו כי Nan-Iav מווסת על ידי Ca2+, ומנגנון הוויסות מתווך על ידי CaM הקשור באופן קונסטיטוטיבי. חשוב לציין, כי ויסות Nav תלוי-Ca2+ זה על ידי CaM שונה באופן משמעותי ממנגנוני הוויסות של תעלות יונים אחרות (למשל, תעלות Na+ תלויות מתח וערוצי TRPV5/6).^{52,53,54,55,56,57}בערוץ Nav1.2, הדומיין C-טרמינלי של CaM מתחבר בצורה סלילית לדומיין C-טרמינלי (CTD), ו-Ca2+ גורם לקשירה של הדומיין N-טרמינלי שלו לחלק הדיסטלי של CTD.⁵⁶בערוץ TRPV5/6, הדומיין C-טרמינלי של CaM נקשר ל-CTH, ו-Ca2+ גורם להתרחבות כלפי מעלה של הדומיין N-טרמינלי שלו לתוך הנקבוביות, ובכך חוסם חדירות קטיונים.^53,54אנו מציעים מודל לתפקוד המווסת על ידי Ca2+ של Nan-Iav-CaM (איור 4h). במודל זה, הדומיין ה-N-טרמינלי של CaM נקשר באופן קונסטיטוטיבי לדומיין ה-C-טרמינלי (CTH) של Iav. במצב מנוחה (ריכוז [Ca2+] נמוך), הדומיין ה-C-טרמינלי של CaM מקיים אינטראקציה עם Nan, מייצב את קונפורמציית ה-ARD ובכך מקדם פתיחת תעלות. קשירת אגוניסט/קוטל חרקים לתעלה גורמת לפתיחת נקבוביות, מה שמוביל לזרימה של Ca2+. לאחר מכן, Ca2+ נקשר ל-CaM, וגורם לדיסוציאציה של הדומיין ה-C-טרמינלי מה-ARD של Nan. מכיוון שחסימת קשירת CaM מבטלת למעשה את ההשפעה המעכבת של Ca2+, דיסוציאציה זו מווסתת את ניידות ה-ARD, ובכך גורמת לעיכוב או דה-סנסיטיזציה התלויים ב-Ca2+. ההתאוששות המהירה של זרמי תעלות לאחר שחרור יוני סידן (איור 4g) מצביעה על כך שמנגנון זה מאפשר תגובות מהירות לאותות עצביים בתיווך Ca2+. יתר על כן, דווח כי אזור ה-C-טרמינל של Iav, אשר עדיין אינו מובן היטב, ממלא תפקידים נוספים במיקוד ערוצים ובוויסות הנוכחי.21
לבסוף, המחקר שלנו מציג את המבנה ברזולוציה גבוהה של קומפלקס תעלות TRP של קוטלי חרקים-קוטלי חרקים בעל חשיבות חקלאית - תגלית שלא הייתה ידועה לנו קודם לכן. ראוי לציין שאפיינו את המבנה והתפקוד של תעלת החרקים בתאים אנושיים (HEK293S GnTi–) ולא בתאי חרקים. לנוכח עמידות גוברת לחומרי חרקים ולחץ מתמשך על ביטחון תזונתי ופתוגנים, עבודתנו מספקת מידע חשוב שיקל על פיתוח קוטלי חרקים חדשים לטובת בריאות האדם וביטחון תזונתי עולמי. מחקרים הראו כי קוטלי חרקים כגון AP יעילים כנגד מזיקים מסוימים כאשר משתמשים בהם בהתאם להוראות התווית ויש להם רעילות חריפה נמוכה למאביקים מועילים, דבר המדגים את בטיחותם הסביבתית.^13,16יתר על כן, בדיקות של כמה נגזרות של AP על יתושים הראו שהם בסופו של דבר מאבדים את יכולתם לעוף. הבנת האופן שבו תרכובות מווסתות אלו נקשרות ל-Nan-Iav תקל על שינוי תרכובות קיימות או על פיתוח תרכובות חדשות ליעילות ויעילות יותר.^{מְדוּיָק}הדברת מזיקים. המחקר שלנו מדגים כי ממשק Nan-Iav ARD קריטי לא רק לוויסות הפעילות של תרכובות אנדוגניות, חומרי הדברה ו-Ca2+-CaM, אלא גם להרכבת תעלות. אנו מציעים כי שיבוש הרכבת הטרודימרים באמצעות מולקולות קטנות עשוי להיות גישה ייחודית ומבטיחה לפיתוח מעכבי תעלות יונים.
מבין שמונת הגנים האורתולוגיים, נבחרו הגנים באורך מלא של החיפושית החומה (Halyomorpha halys) Nanchung ו-Inactive, שהציגו יציבות מצוינת בדטרגנטים. הגנים המסונתזים עברו אופטימיזציה לקודונים לביטוי אנושי ושובטו לתוך וקטור pBacMam pCMV-DEST (Life Technologies) באמצעות אתרי הגבלה XhoI ו-EcoRI. זה הבטיח שהשיבוטים יהיו במסגרת עם תגי GFP-FLAG-10xHis ו-mCherry-FLAG-10xHis בקצה ה-C, אשר נחתכים על ידי פרוטאז HRC-3C (PPX), מה שמאפשר יצירת גנים עצמאיים.^{הַבָּעָה}הפריימרים ששימשו לשיבוט Nanchung ו-Inactive לתוך וקטור pBacMam היו כדלקמן:
תמונות מיקרוסקופיות של חלקיקים בודדים התקבלו במיקרוסקופ אלקטרונים חודר (FEI) מדגם Titan Krios G2 המצויד במצלמת K3 ובמסנן אנרגיה Gatan BioQuantum. המיקרוסקופ הופעל ב-300 keV, עם הגדרת אנרגיה של 20 eV, גודל פיקסל דגימה של 1.08 Å/פיקסל (הגדלה נומינלית של פי 81,000), וגרדיאנט דפוקס שנע בין -0.8 ל- -2.2 מיקרומטר. הקלטת וידאו בוצעה בקצב של 40 פריימים לשנייה באמצעות מיקרוסקופ Latitude S (Gatan) עם קצב מינון נומינלי של 25 e–px⁻¹ לשנייה, זמן חשיפה של 2.4 שניות ומינון כולל של כ-60 e–Å⁻².
תיקון תנועה מושרה על ידי קרן ושקלול מינון בוצעו על סרט באמצעות MotionCor2 ב-RELION 4.061. אומדן פרמטרים של פונקציית העברת ניגודיות (CTF) בוצע ב-cryoSPARC באמצעות שיטת אומדן CTF מבוססת טלאים62. פוטומיקרוגרפים עם רזולוציית התאמת CTF ≥4Å הוצאו מניתוח עוקב. בדרך כלל, תת-קבוצה של 500-1000 פוטומיקרוגרפים שימשה לבחירת נקודות ב-cryoSPARC, ולאחר מכן מספר סבבים של סיווג דו-ממדי לאחר סינון כדי לקבל תמונת ייחוס ברורה לבחירת חלקיקים מבוססת תבנית. לאחר מכן חולצו החלקיקים באמצעות תיבות גבול של 64 פיקסלים וחלוקה 4-fold binning. מספר סבבים של סיווג דו-ממדי בוצעו כדי להסיר קטגוריות חלקיקים לא רצויות. המודל התלת-ממדי הראשוני שוחזר באמצעות שחזור ab initio ועידן באמצעות עידון לא אחיד ב-cryoSPARC. סיווג תלת-ממדי בוצע ב-cryoSPARC או RELION על סמך הטרוגניות של ARD. לא נצפתה הטרוגניות משמעותית של תחומי הממברנה. החלקיקים עוידנו באמצעות שיטות C1 ו-C2; חלקיקים בעלי רזולוציית C2 גבוהה יותר נחשבו סימטריים ביחס ל-C2 ויובאו ל-RELION לצורך זיקוק בייסיאני. לאחר מכן, החלקיקים הועברו חזרה ל-cryoSPARC לצורך זיקוק סופי לא אחיד ומקומי. הרזולוציה הסופית וספירת החלקיקים מוצגים בטבלה 1.
בעת עיבוד פנטמרים של Nan+AP, חקרנו שיטות שונות לשיפור הרזולוציה של תחומי הממברנה (במיוחד אזור הנקבוביות), כגון חיסור אותות ומיסוך TMD. עם זאת, ניסיונות אלה לא צלחו עקב אי-הסדר הקיצוני הפוטנציאלי באזור הנקבוביות וההטרוגניות הכוללת של ה-TMD. הרזולוציה הסופית חושבה באמצעות מסכה שנוצרה אוטומטית על ידי שיטת העיבוד הלא אחידה ב-cryoSPARC, כשהיא מכוונת בעיקר לאזור ARD. פעולה זו השיגה רזולוציה גבוהה משמעותית מזו של תחומי הממברנה (במיוחד אזור VSLD).
מודלים ראשוניים de novo של צורות ה-apo של הבאגים Nanchung ו-Inactive נוצרו לראשונה באמצעות Coot63, ומודלים של הבאגים Nan ו-Iav נוצרו באמצעות AlphaFold264 כדי לזהות אזורים בעלי ביטחון נמוך. מידול קלמודולין התבסס על התאמות גוף קשיח של המודלים הקושרים Ca2+ ונטולי Ca2+ ב-PDB accessions 4JPZ56 ו-1CFD65, בהתאמה. המודלים עברו חידוד באמצעות חידוד כדורי כדי להבטיח סטריאוכימיה נכונה וגיאומטריה טובה. לאחר מכן, פוספטידילכולין, פוספטידילאתנולמין ופוספטידילסרין עוצבו כצפיפויות ליפידים מוגדרות היטב, והליגנדים NAM ו-AP הוצבו בצפיפויות המתאימות בצמתים ההדוקים. קבצי אילוץ נוצרו ממחרוזת SMILES של האיזופורמים באמצעות eLBOW ב-PHENIX66. לבסוף, המודלים עברו חידוד במרחב אמיתי ב-PHENIX באמצעות חיפוש רשת מקומי ומזעור גלובלי עם אילוצי מבנה משני. שרת MolProbity שימש לעידון המודל ולניתוח מבני, והדמיות בוצעו באמצעות PyMOL ו-UCSF Chimera X. 67,68,69 ניתוח צמצם בוצע באמצעות שרת HOLE,70 ומיפוי שימור רצפים בוצע באמצעות שרת Consurf.71
ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות Igor Pro 6.2, Excel Office 365 ו-GraphPad Prism 7.0. כל הנתונים הכמותיים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן (SEM). מבחן t של סטודנט (דו-צדדי, לא מזווג) שימש להשוואת שתי קבוצות. ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA) ולאחר מכן מבחן פוסט-הוק של דאנט שימש להשוואת קבוצות מרובות. *P< 0.05, **P< 0.01, ו-***Pערכים < 0.001 נחשבו מובהקים סטטיסטית בהתאם להתפלגות הנתונים. ערכי Kd ו-Ki, ומרווחי הסמך האסימטריים שלהם של 95% חושבו באמצעות GraphPad Prism 10.
לפרטים נוספים על מתודולוגיית המחקר, אנא עיינו בסיכום דוח תיק העבודות של הטבע המקושר למאמר זה.
המודל הראשוני נבנה באמצעות מודלי הקלמודולין ממאגרי המידע PDB 4JPZ ו-1CFD. הקואורדינטות הופקדו בבנק נתוני החלבון (PDB) תחת מספרי הגישה 9NVN (Nan-Iav-CaM ללא ליגנד), 9NVO (Nan-Iav-CaM קשור לניקוטינאמיד), 9NVP (Nan-Iav-CaM קשור לניקוטינאמיד ו-EDTA), 9NVQ (Nan-Iav-CaM קשור לאפנידולפירולין וסידן), 9NVR (Nan-Iav-CaM קשור לאפנידולפירולין ו-EDTA), ו-9NVS (Nan pentamer קשור לאפנידולפירולין). תמונות מיקרוסקופיית קריו-אלקטרונים המתאימות הופקדו במסד הנתונים של מיקרוסקופיית אלקטרונים (EMDB) תחת מספרי הגישה הבאים: EMD-49844 (Nan-Iav-CaM ללא ליגנד), EMD-49845 (קומפלקס Nan-Iav-CaM עם ניקוטינאמיד), EMD-49846 (קומפלקס Nan-Iav-CaM עם ניקוטינאמיד ו-EDTA), EMD-49847 (קומפלקס Nan-Iav-CaM עם אפידופירולין וסידן), EMD-49848 (קומפלקס Nan-Iav-CaM עם אפידופירולין ו-EDTA), ו-EMD-49849 (קומפלקס Nan pentamer עם אפידופירולין). הנתונים הגולמיים לניתוח הפונקציונלי מוצגים במאמר זה.