תרופת האנטלמינציה N,N-diethyl-m-toluamide (DEETדווח כי הוא מעכב AChE (אצטילכולין אסטראז) ויש לו תכונות מסרטנות פוטנציאליות עקב וסקולריזציה מוגזמת. במאמר זה, אנו מראים ש-DEET מגרה באופן ספציפי תאי אנדותל המקדמים אנגיוגנזה, ובכך מגבירים את צמיחת הגידול. DEET מפעיל תהליכים תאיים המובילים לאנגיוגנזה, כולל התפשטות, הגירה והידבקות. זה קשור לייצור NO מוגבר וביטוי VEGF בתאי אנדותל. השתקה של M3 או שימוש במעכבי M3 תרופתיים ביטלו את כל ההשפעות הללו, מה שמצביע על כך שאנגיוגנזה הנגרמת על ידי DEET רגישה ל-M3. ניסויים הכוללים איתות סידן בתאי אנדותל ותאי HEK המבטאים יתר על המידה קולטני M3, כמו גם מחקרי קישור ועגינה, מצביעים על כך ש-DEET פועל כמאפנן אלוסטרי של קולטני M3. יתר על כן, DEET מעכב AChE, ובכך מגביר את הזמינות הביולוגית של אצטילכולין וקשירתו לקולטני M3, ומגביר את ההשפעות הפרואנגיוגניות באמצעות ויסות אלוסטרי.
ECs ראשוני בודדו מאבי העורקים של עכברים שוויצרים. שיטת החילוץ הותאמה מפרוטוקול Kobayashi 26. ECs Murine תורבו במדיום EBM-2 בתוספת 5% FBS מושבתת בחום עד למעבר הרביעי.
ההשפעה של שני ריכוזים של DEET על התפשטות של HUVEC, U87MG או BF16F10 נותחה באמצעות ערכת CyQUANT Cell Proliferation Assay (Molecular Probes, C7026). בקצרה, 5.103 תאים לבאר נזרעו בצלחת עם 96 בארים, הורשו להיצמד למשך הלילה, ולאחר מכן טופלו ב-DEET למשך 24 שעות. לאחר הסרת מצע הגידול, הוסף תמיסת קושרת צבע לכל באר של המיקרו-פלט ודגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. רמות הקרינה נקבעו באמצעות קורא Mithras LB940 multimode microplate (Berthold Technologies, Bad Wildbad, גרמניה) המצויד במסנני עירור של 485 ננומטר ומסנני פליטה של 530 ננומטר.
HUVEC נזרעו בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 104 תאים לבאר. תאים טופלו עם DEET במשך 24 שעות. כדאיות התא הוערכה באמצעות בדיקת MTT קולורימטרית (Sigma-Aldrich, M5655). ערכי צפיפות אופטית התקבלו בקורא מיקרו-צלחות רב-מוד (Mithras LB940) באורך גל של 570 ננומטר.
ההשפעות של DEET נחקרו באמצעות מבחני אנגיוגנזה במבחנה. טיפול ב-10-8 M או 10-5 M DEET הגביר את היווצרות אורך נימי ב-HUVECs (איור 1a, b, פסים לבנים). בהשוואה לקבוצת הביקורת, טיפול בריכוזי DEET שנעו בין 10-14 ל-10-5 M הראה שאורך הנימים הגיע לרמה של 10-8 M DEET (איור משלים. S2). לא נמצא הבדל משמעותי בהשפעה הפרואנגיוגנית במבחנה של HUVECs שטופלו ב-DEET בטווח הריכוזים של 10-8 M ו-10-5 M.
כדי לקבוע את ההשפעה של DEET על neovascularization, ביצענו מחקרים neovascularization in vivo. לאחר 14 ימים, עכברים שהוזרקו להם תאי אנדותל שהותרבו מראש ב-10-8 M או 10-5 M DEET הראו עלייה משמעותית בתכולת ההמוגלובין (איור 1c, פסים לבנים).
יתרה מזאת, ניאווסקולריזציה המושרה על ידי DEET נחקרה בעכברים נושאי Xenograft של U87MG אשר הוזרקו מדי יום (ip) עם DEET במינון הידוע כמעורר ריכוזי פלזמה של 10-5 M, וזה תקין בבני אדם חשופים. ב-23. גידולים ניתנים לזיהוי (כלומר גידולים מעל 100 מ"מ) נצפו 14 ימים לאחר הזרקת תאי U87MG לעכברים. ביום 28, צמיחת הגידול הוגברה באופן משמעותי בעכברים שטופלו ב-DEET בהשוואה לעכברי ביקורת (איור 1ד, ריבועים). יתר על כן, צביעת CD31 של גידולים הראתה ש-DEET הגדיל באופן משמעותי את השטח הנימים אך לא את צפיפות המיקרו-כלי. (איור 1e–g).
כדי לקבוע את תפקידם של קולטנים מוסקריניים בהתרבות המושרה על ידי DETA, נעשה שימוש ב-10-8 M או 10-5 M DETA בנוכחות pFHHSiD (10-7 M, אנטגוניסט סלקטיבי לקולטן M3). טיפול ב-HUVEC. pFHHSiD חסם לחלוטין את תכונות השגשוג של DETA בכל הריכוזים (טבלה 1).
בתנאים אלה, בדקנו גם האם DEET יגדיל את אורך הנימים בתאי HUVEC. באופן דומה, pFHHSiD מנע באופן משמעותי אורך נימי המושרה על ידי DEET (איור 1a, b, פסים אפורים). יתר על כן, ניסויים דומים בוצעו עם M3 siRNA. למרות שסיRNA הבקרה לא היה יעיל בקידום היווצרות נימים, השתקה של הקולטן המוסקריני M3 ביטלה את היכולת של DEET להגדיל את אורך הנימים (איור 1a, ב, פסים שחורים).
יתר על כן, הן 10-8 M או 10-5 M DEET-Induced vascularization in vitro ו neovascularization in vivo נחסמו לחלוטין על ידי pFHHSiD (איור 1c, d, עיגולים). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DEET מקדם אנגיוגנזה דרך מסלול רגיש לאנטגוניסטים סלקטיביים של קולטן M3 או M3 siRNA.
AChE הוא המטרה המולקולרית של DEET. תרופות כגון דונפזיל, הפועלות כמעכבי AChE, יכולות לעורר אנגיוגנזה של EC במבחנה ובמודלים של איסכמיה אחורית של עכברים14. בדקנו את ההשפעה של שני ריכוזים של DEET על פעילות האנזים AChE ב-HUVEC. ריכוז נמוך (10-8 M) וגבוה (10-5 M) של DEET הפחית את פעילות AChE האנדותל בהשוואה לתנאי הביקורת (איור 2).
שני הריכוזים של DEET (10-8 M ו-10-5 M) הפחיתו את פעילות האצטילכולין אסטראז ב-HUVEC. BW284c51 (10-5 M) שימש כביקורת עבור מעכבי אצטילכולין אסטראז. התוצאות מבוטאות כאחוז מפעילות AChE ב-HUVEC שטופלו בשני הריכוזים של DEET בהשוואה לתאים שטופלו בכלי רכב. הערכים מבוטאים כממוצע ± SEM של שישה ניסויים עצמאיים. *p < 0.05 בהשוואה לבקרה (בדיקת השוואה מרובה של קרוסקאל-וואליס ודאן).
תחמוצת החנקן (NO) מעורבת בתהליך האנגיוגני 33, לכן נחקר ייצור NO ב- HUVECs מעוררי DEET. ייצור NO אנדותל שטופל ב-DEET גדל בהשוואה לתאי ביקורת, אך הגיע למשמעות רק במינון של 10-8 M (איור 3c). כדי לקבוע את השינויים המולקולריים השולטים בייצור NO המושרה על ידי DEET, נותחו ביטוי והפעלה של eNOS באמצעות Western blotting. למרות שטיפול ב-DEET לא שינה את ביטוי eNOS, הוא הגביר באופן משמעותי את הזרחון של eNOS באתר ההפעלה שלו (Ser-1177) תוך הקטנת האתר המעכב שלו (Thr-495) בהשוואה לתאים לא מטופלים בזרחון eNOS (איור 3d). יתר על כן, היחס בין eNOS מזורחן באתר ההפעלה ובאתר המעכב חושב לאחר נורמליזציה של כמות ה-eNOS הפוספוריל לכמות הכוללת של האנזים. יחס זה גדל באופן משמעותי ב-HUVECs שטופלו עם כל ריכוז של DEET בהשוואה לתאים לא מטופלים (איור 3ד).
לבסוף, הביטוי של VEGF, אחד הגורמים הפרואנגיוגניים העיקריים, נותח על ידי Western blotting. DEET הגדיל באופן משמעותי את ביטוי VEGF, בעוד pFHHSiD חסם לחלוטין את הביטוי הזה.
מאחר שההשפעות של DEET רגישות הן לחסימה תרופתית והן להורדת ויסות של קולטני M3, בדקנו את ההשערה ש-DEET עשוי לשפר את איתות הסידן. באופן מפתיע, DEET לא הצליח להעלות סידן ציטופלזמי ב-HUVEC (לא מוצגים נתונים) וב-HEK/M3 (איור 4a, ב) עבור שני הריכוזים שבהם נעשה שימוש.
זמן פרסום: 30 בדצמבר 2024