התרופה האנטי-תלמינטית N,N-דיאתיל-m-טולומיד (דיט) דווח כי הוא מעכב AChE (אצטילכולין אסטראז) ויש לו תכונות מסרטנות פוטנציאליות עקב וסקולריזציה מוגזמת. במאמר זה, אנו מראים כי DEET מגרה באופן ספציפי תאי אנדותל המקדמים אנגיוגנזה, ובכך מגביר את צמיחת הגידול. DEET מפעיל תהליכים תאיים המובילים לאנגיוגנזה, כולל התפשטות, נדידה והידבקות. זה קשור לעלייה בייצור NO וביטוי VEGF בתאי אנדותל. השתקת M3 או שימוש במעכבי M3 תרופתיים ביטלו את כל ההשפעות הללו, דבר המצביע על כך שאנגיוגנזה המושרה על ידי DEET רגישה ל-M3. ניסויים הכוללים איתות סידן בתאי אנדותל ו-HEK המבטאים ביתר קולטני M3, כמו גם מחקרי קשירה ועגינה, מצביעים על כך ש-DEET פועל כמודולטור אלוסטרי של קולטני M3. יתר על כן, DEET מעכב AChE, ובכך מגביר את הזמינות הביולוגית של אצטילכולין ואת קישורו לקולטני M3, ומשפר את ההשפעות הפרו-אנגיוגנזה באמצעות ויסות אלוסטרי.
תאי EC ראשוניים בודדו מאבי העורקים של עכברים שוויצריים. שיטת החילוץ הותאמה מפרוטוקול קוביאשי 26. תאי EC עכבריים גודלו במדיום EBM-2 בתוספת 5% FBS מומת בחום עד למעבר הרביעי.
ההשפעה של שני ריכוזים של DEET על התפשטות HUVEC, U87MG, או BF16F10 נותחה באמצעות ערכת CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit (Molecular Probes, C7026). בקצרה, 5,103 תאים לכל באר נזרעו בצלחת בת 96 בארות, הותירו להם להיקשר למשך הלילה, ולאחר מכן טופלו ב-DEET למשך 24 שעות. לאחר הסרת מצע הגידול, הוסיפו תמיסת קשירת צבע לכל באר של המיקרו-צלחת ודגרו את התאים ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. רמות הפלואורסצנציה נקבעו באמצעות קורא מיקרו-צלחות רב-מצבי Mithras LB940 (Berthold Technologies, Bad Wildbad, גרמניה) המצויד במסנני עירור של 485 ננומטר ומסנני פליטה של 530 ננומטר.
תאי HUVEC נזרעו בצלחות של 96 בארות בצפיפות של 104 תאים לבאר. התאים טופלו ב-DEET למשך 24 שעות. כדאיות התאים הוערכה באמצעות מבחן MTT קולורימטרי (Sigma-Aldrich, M5655). ערכי צפיפות אופטית התקבלו בקורא מיקרופלטות רב-מצבי (Mithras LB940) באורך גל של 570 ננומטר.
השפעות DEET נחקרו באמצעות מבחני אנגיוגנזה in vitro. טיפול ב-10-8 M או 10-5 M DEET הגביר את היווצרות אורך הנימים ב-HUVECs (איור 1a, b, פסים לבנים). בהשוואה לקבוצת הביקורת, טיפול בריכוזי DEET שנעו בין 10-14 ל-10-5 M הראה שאורך הנימים הגיע לרמה מיידית ב-10-8 M DEET (איור משלים S2). לא נמצא הבדל משמעותי בהשפעה הפרו-אנגיוגנזה in vitro של HUVECs שטופלו ב-DEET בטווח הריכוזים של 10-8 M ו-10-5 M.
כדי לקבוע את ההשפעה של DEET על נאווסקולריזציה, ביצענו מחקרי נאווסקולריזציה in vivo. לאחר 14 ימים, עכברים שהוזרקו להם תאי אנדותל שעברו תרבית מראש של 10-8 M או 10-5 M DEET הראו עלייה משמעותית בתכולת ההמוגלובין (איור 1c, פסים לבנים).
יתר על כן, נחקרה נאו-וסקולריזציה מושרה על ידי DEET בעכברים נושאי שתל U87MG שקיבלו הזרק יומי (ip) של DEET במינון הידוע כגורם לריכוזי פלזמה של 10-5 M, שהוא נורמלי בבני אדם שנחשפו. ב-23. גידולים ניתנים לגילוי (כלומר גידולים >100 mm3) נצפו 14 ימים לאחר הזרקת תאי U87MG לעכברים. ביום 28, צמיחת הגידול השתפרה משמעותית בעכברים שטופלו ב-DEET בהשוואה לעכברי ביקורת (איור 1d, ריבועים). יתר על כן, צביעת CD31 של גידולים הראתה ש-DEET הגדיל משמעותית את שטח הנימים אך לא את צפיפות המיקרו-כלי הדם. (איור 1e-g).
כדי לקבוע את תפקידם של קולטנים מוסקריניים בהתפשטות המושרה על ידי DETA, נעשה שימוש ב-10-8 M או 10-5 M DETA בנוכחות pFHHSiD (10-7 M, אנטגוניסט סלקטיבי לקולטן M3). טיפול ב-HUVEC. pFHHSiD חסם לחלוטין את תכונות ההתפשטות של DETA בכל הריכוזים (טבלה 1).
בתנאים אלה, בדקנו גם האם DEET יגדיל את אורך הנימים בתאי HUVEC. באופן דומה, pFHHSiD מנע באופן משמעותי את אורך הנימים המושרה על ידי DEET (איור 1א', ב', פסים אפורים). יתר על כן, ניסויים דומים בוצעו עם siRNA M3. למרות ש-siRNA הביקורת לא היה יעיל בקידום היווצרות נימים, השתקת הקולטן המוסקריני M3 ביטלה את יכולתו של DEET להגדיל את אורך הנימים (איור 1א', ב', פסים שחורים).
יתר על כן, הן וסקולריזציה מושרת על ידי 10-8 M או 10-5 M DEET in vitro והן נאו-וסקולריזציה in vivo נחסמו לחלוטין על ידי pFHHSiD (איור 1c, d, עיגולים). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-DEET מקדם אנגיוגנזה דרך מסלול רגיש לאנטגוניסטים סלקטיביים לקולטן M3 או M3 siRNA.
AChE הוא המטרה המולקולרית של DEET. תרופות כמו דונפזיל, הפועלות כמעכבי AChE, יכולות לעורר אנגיוגנזה של תאי רחם כרוני (EC) במבחנה ובמודלים של איסכמיה בגפיים אחוריות של עכברים14. בדקנו את ההשפעה של שני ריכוזים של DEET על פעילות אנזים AChE ב-HUVEC. ריכוזים נמוכים (10-8 M) וגבוהים (10-5 M) של DEET הפחיתו את פעילות AChE האנדותל בהשוואה לתנאי ביקורת (איור 2).
שני ריכוזי DEET (10-8 M ו-10-5 M) הפחיתו את פעילות האצטילכולין אסטראז על HUVEC. BW284c51 (10-5 M) שימש כביקורת למעכבי אצטילכולין אסטראז. התוצאות מבוטאות כאחוז מפעילות AChE על HUVEC שטופל בשני ריכוזי DEET בהשוואה לתאים שטופלו בתרופה. הערכים מבוטאים כממוצע ± SEM של שישה ניסויים בלתי תלויים. *p < 0.05 בהשוואה לביקורת (מבחן ההשוואה המרובה של קרוסקל-ואליס ודאן).
תחמוצת החנקן (NO) מעורבת בתהליך האנגיוגני 33, לכן נחקר ייצור NO בתאי HUVEC המגורים על ידי DEET. ייצור NO אנדותלי שטופלו ב-DEET גדל בהשוואה לתאי ביקורת, אך הגיע למשמעות רק במינון של 10-8 M (איור 3c). כדי לקבוע את השינויים המולקולריים השולטים בייצור NO המושרה על ידי DEET, ביטוי והפעלה של eNOS נותחו על ידי Western blotting. למרות שטיפול ב-DEET לא שינה את ביטוי eNOS, הוא הגביר משמעותית את הזרחון של eNOS באתר ההפעלה שלו (Ser-1177) תוך הפחתת אתר העיכוב שלו (Thr-495) בהשוואה לתאים שלא טופלו בזרחון eNOS (איור 3d). יתר על כן, היחס בין eNOS שעבר זרחון באתר ההפעלה ובאתר העיכוב חושב לאחר נרמול כמות ה-eNOS שעבר זרחון לכמות הכוללת של האנזים. יחס זה גדל משמעותית ב-HUVEC שטופלו בכל ריכוז של DEET בהשוואה לתאים שלא טופלו (איור 3d).
לבסוף, נותח הביטוי של VEGF, אחד הגורמים הפרו-אנגיוגניים העיקריים, באמצעות Western blotting. DEET הגביר משמעותית את ביטוי VEGF, בעוד ש-pFHHSiD חסם לחלוטין ביטוי זה.
מאחר שהשפעות DEET רגישות הן לחסימה פרמקולוגית והן לירידה ברמת קולטני M3, בדקנו את ההשערה ש-DEET עשוי לשפר את רמת הסידן. באופן מפתיע, DEET לא הצליח להגביר את רמות הסידן הציטופלזמי ב-HUVEC (נתונים לא מוצגים) וב-HEK/M3 (איור 4א', 4ב') בשני הריכוזים בהם נעשה שימוש.
זמן פרסום: 30 בדצמבר 2024