השפעות סינרגטיות של מווסתי צמיחת צמחים וננו-חלקיקי תחמוצת ברזל על אורגנוגנזה במבחנה וייצור תרכובות ביו-אקטיביות בערב סנט ג'ון

במחקר זה, ההשפעות הממריצות של הטיפול המשולב ב-מווסתי צמיחת צמחיםנחקרו ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל (Fe₃O₄-NPs) על מורפוגנזה במבחנה וייצור מטבוליטים משניים ב-*Hypericum perforatum* L. הטיפול האופטימלי [2,4-D (0.5 מ"ג/ליטר) + קינטין (2 מ"ג/ליטר) + Fe₃O₄-NPs (4 מ"ג/ליטר)] שיפר משמעותית את פרמטרי גידול הצמח: גובה הצמח גדל ב-59.6%, אורך השורש ב-114.0%, מספר הניצנים ב-180.0% ומשקל הקלוס הטרי ב-198.3% בהשוואה לקבוצת הביקורת. טיפול משולב זה גם שיפר את יעילות ההתחדשות (50.85%) והגדיל את תכולת ההיפריצין ב-66.6%. ניתוח GC-MS גילה תכולה גבוהה של היפרוזיד, β-פתולן וצטיל אלכוהול, המהווים 93.36% משטח השיא הכולל, בעוד שתכולת הפנולים והפלבנואידים הכוללים עלתה עד 80.1%. תוצאות אלו מצביעות על כך שווסתי צמיחת צמחים (PGRs) וננו-חלקיקי Fe₃O₄ (Fe₃O₄-NPs) מפעילים אפקט סינרגטי על ידי עידוד אורגנוגנזה והצטברות של תרכובות ביו-אקטיביות, המייצגות אסטרטגיה מבטיחה לשיפור ביוטכנולוגי של צמחי מרפא.
צמח סנט ג'ון (Hypericum perforatum L.), הידוע גם בשם צמח סנט ג'ון, הוא צמח עשבוני רב שנתי ממשפחת ה-Hypericaceae בעל ערך כלכלי.[1] רכיביו הביו-אקטיביים הפוטנציאליים כוללים טאנינים טבעיים, קסנטונים, פלורוגלוצינול, נפתלין-דיאנטרון (היפרין ופסאודו-היפרין), פלבנואידים, חומצות פנוליות ושמנים אתריים.[2,3,4] ניתן להרבות צמח סנט ג'ון בשיטות מסורתיות; עם זאת, העונתיות של השיטות המסורתיות, נביטת זרעים נמוכה ורגישות למחלות מגבילות את הפוטנציאל שלו לגידול בקנה מידה גדול וליצירה מתמשכת של מטבוליטים משניים.[1,5,6]
לפיכך, תרבית רקמות במבחנה נחשבת לשיטה יעילה לריבוי מהיר של צמחים, שימור משאבי נבט פלזמה והגדלת התפוקה של תרכובות רפואיות [7, 8]. מווסתי גדילת צמחים (PGRs) ממלאים תפקיד מכריע בוויסות המורפוגנזה והם נחוצים לגידול במבחנה של קאלוס ואורגניזמים שלמים. אופטימיזציה של ריכוזיהם ושילוביהם היא קריטית להשלמה מוצלחת של תהליכי התפתחות אלה [9]. לכן, הבנת ההרכב והריכוז המתאימים של מווסתים חשובה לשיפור הצמיחה ויכולת ההתחדשות של צמח הפריחה (H. perforatum) [10].
ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל (Fe₃O₄) הם סוג של ננו-חלקיקים שפותחו או מפותחים עבור תרבית רקמה. ל-Fe₃O₄ תכונות מגנטיות משמעותיות, תאימות ביולוגית טובה ויכולת לקדם צמיחת צמחים ולהפחית לחץ סביבתי, ולכן הוא משך תשומת לב רבה בתכנון תרבית רקמה. יישומים פוטנציאליים של ננו-חלקיקים אלה עשויים לכלול אופטימיזציה של תרבית חוץ גופית לקידום חלוקת תאים, שיפור ספיגת חומרים מזינים והפעלת אנזימים נוגדי חמצון [11].
למרות שננו-חלקיקים הראו השפעות טובות לקידום צמיחת צמחים, מחקרים על יישום משולב של ננו-חלקיקי Fe₃O₄ ווסתים צפויים לצמיחה צמחית ב-*H. perforatum* נותרו נדירים. כדי למלא את פער הידע הזה, מחקר זה העריך את ההשפעות של השפעותיהם המשולבות על מורפוגנזה וייצור מטבוליטים משניים במבחנה כדי לספק תובנות חדשות לשיפור המאפיינים של צמחי מרפא. לכן, למחקר זה שתי מטרות: (1) אופטימיזציה של ריכוז ווסתים צפויים לצמיחה צמחית כדי לקדם ביעילות היווצרות יבלות, התחדשות נצרים והשרשה במבחנה; ו-(2) הערכת ההשפעות של ננו-חלקיקי Fe₃O₄ על פרמטרי צמיחה במבחנה. תוכניות עתידיות כוללות הערכת שיעור ההישרדות של צמחים שהתחדשו במהלך התאקלמות (in vitro). צפוי שתוצאות מחקר זה ישפרו משמעותית את יעילות המיקרו-ריבוי של *H. perforatum*, ובכך יתרום לשימוש בר-קיימא וליישומים ביוטכנולוגיים של צמח מרפא חשוב זה.
במחקר זה, השגנו גזרי עלים מצמחי ערבה חד-שנתיים של צמחי ג'ון (צמחי אם) שגודלו בשדה. גזרי עלים אלה שימשו לאופטימיזציה של תנאי גידול חוץ גופיים (in vitro). לפני הגידול, העלים נשטפו היטב תחת מים מזוקקים זורמים במשך מספר דקות. לאחר מכן, משטחי הגזרי עלו מחוטאים על ידי טבילה באתנול 70% למשך 30 שניות, ולאחר מכן טבילה בתמיסת נתרן תת-כלוריט (NaOCl) 1.5% המכילה כמה טיפות של Tween 20 למשך 10 דקות. לבסוף, הגזרי עלים נשטפו שלוש פעמים במים מזוקקים סטריליים לפני העברתם למצע הגידול הבא.
במהלך ארבעת השבועות הבאים נמדדו פרמטרי התחדשות הנצרים, כולל קצב התחדשות, מספר נבטים לכל אקספלנט ואורך הנצרה. כאשר הנצרים שהתחדשו הגיעו לאורך של לפחות 2 ס"מ, הם הועברו למצע השתרשות המורכב ממצע MS בחצי חוזק, 0.5 מ"ג/ליטר חומצה אינדולבוטירית (IBA) ו-0.3% גואר גאם. תרבית ההשרשה נמשכה במשך שלושה שבועות, במהלכם נמדדו קצב ההשרשה, מספר השורשים ואורך השורשים. כל טיפול חזר על עצמו שלוש פעמים, כאשר גודלו 10 אקספלנטים לכל חוזר, מה שהניב כ-30 אקספלנטים לכל טיפול.
גובה הצמח נמדד בסנטימטרים (ס"מ) באמצעות סרגל, מבסיס הצמח ועד קצה העלה הגבוה ביותר. אורך השורש נמדד במילימטרים (מ"מ) מיד לאחר הוצאה זהירה של השתילים והוצאת מצע הגידול. מספר הניצנים לכל צמח נספר ישירות על כל צמח. מספר הכתמים השחורים על העלים, המכונים גושים, נמדד ויזואלית. גושים שחורים אלה נחשבים לבלוטות המכילות היפריצין, או כתמים חמצוניים, ומשמשים כאינדיקטור פיזיולוגי לתגובת הצמח לטיפול. לאחר הסרת כל מצע הגידול, משקלם הטרי של השתילים נמדד באמצעות משקל אלקטרוני בדיוק של מיליגרם (מ"ג).
השיטה לחישוב קצב היווצרות הקלוס היא כדלקמן: לאחר גידול אקספלנטים במצע המכיל מווסתי גדילה שונים (קינאזות, 2,4-D ו-Fe3O4) במשך ארבעה שבועות, סופרים את מספר האקספלנטים המסוגלים ליצור קליוס. הנוסחה לחישוב קצב היווצרות הקלוס היא כדלקמן:
כל טיפול חזר על עצמו שלוש פעמים, כאשר בכל חזרה נבדקו לפחות 10 אקספלנטים.
קצב ההתחדשות משקף את חלקה של רקמת הקאלוס שמשלימה בהצלחה את תהליך התמיינות הניצנים לאחר שלב היווצרות הקאלוס. מדד זה מדגים את יכולתה של רקמת הקאלוס להפוך לרקמה ממוינת ולגדול לאיברי צמח חדשים.
מקדם ההשרשה הוא היחס בין מספר הענפים המסוגלים להשריש למספר הענפים הכולל. מדד זה משקף את הצלחת שלב ההשרשה, שהוא קריטי במיקרו-ריבוי ובריבוי צמחים, שכן השרשה טובה עוזרת לשתילים לשרוד טוב יותר בתנאי גידול.
תרכובות היפריצין חולצו עם 90% מתנול. חמישים מ"ג של חומר צמחי מיובש נוספו ל-1 מ"ל של מתנול ועברו סוניקציה למשך 20 דקות במהירות 30 קילוהרץ במכונת ניקוי אולטרסאונד (דגם A5120-3YJ) בטמפרטורת החדר בחושך. לאחר הסוניקציה, הדגימה סורכזה במהירות 6000 סל"ד למשך 15 דקות. הנוזל העליון נאסף, וספיגת ההיפריצין נמדדה ב-592 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר Plus-3000 S לפי השיטה שתוארה על ידי קונסייסאו ואחרים [14].
רוב הטיפולים עם מווסתי צמיחת צמחים (PGRs) וננו-חלקיקי תחמוצת ברזל (Fe₃O₄-NPs) לא גרמו להיווצרות גושים שחורים על עלי נבטים משוחזרים. לא נצפו גושים באף אחד מהטיפולים עם 0.5 או 1 מ"ג/ליטר 2,4-D, 0.5 או 1 מ"ג/ליטר קינטין, או 1, 2 או 4 מ"ג/ליטר ננו-חלקיקי תחמוצת ברזל. מספר שילובים הראו עלייה קלה בהתפתחות הגושים (אך לא מובהקת סטטיסטית) בריכוזים גבוהים יותר של ננו-חלקיקי קינטין ו/או תחמוצת ברזל, כגון שילוב של 2,4-D (0.5-2 מ"ג/ליטר) עם קינטין (1-1.5 מ"ג/ליטר) וננו-חלקיקי תחמוצת ברזל (2-4 מ"ג/ליטר). תוצאות אלו מוצגות באיור 2. גושים שחורים מייצגים בלוטות עשירות בהיפריצין, הן טבעיות והן מועילות. במחקר זה, גושים שחורים נקשרו בעיקר להשחמת רקמות, דבר המצביע על סביבה נוחה להצטברות היפריצין. טיפול בננו-חלקיקים של 2,4-D, קינטין ו-Fe₃O₄ קידם צמיחת יבלות, הפחית את ההשחמה והגדיל את תכולת הכלורופיל, דבר המצביע על שיפור בתפקוד המטבולי והפחתה פוטנציאלית של נזק חמצוני [37]. מחקר זה העריך את השפעות הקינטין בשילוב עם ננו-חלקיקים של 2,4-D ו-Fe₃O₄ על הצמיחה וההתפתחות של יבלת של יערת סנט ג'ון (איור 3א-ז). מחקרים קודמים הראו כי לננו-חלקיקי Fe₃O₄ יש פעילות נגד פטריות ואנטי-מיקרוביאלית [38, 39] וכאשר משתמשים בהם בשילוב עם מווסתי צמיחת צמחים, הם יכולים לעורר מנגנוני הגנה של הצמח ולהפחית מדדי לחץ תאי [18]. למרות שהביוסינתזה של מטבוליטים משניים מווסתת גנטית, התפוקה בפועל שלהם תלויה במידה רבה בתנאי הסביבה. שינויים מטבוליים ומורפולוגיים יכולים להשפיע על רמות המטבוליטים המשניים על ידי ויסות הביטוי של גנים ספציפיים של צמחים ותגובה לגורמים סביבתיים. יתר על כן, מעוררים יכולים לעורר את ההפעלה של גנים חדשים, אשר בתורם מגרים פעילות אנזימטית, ובסופו של דבר מפעילים מסלולים ביוסינתטיים מרובים ומובילים להיווצרות מטבוליטים משניים. יתר על כן, מחקר נוסף הראה כי הפחתת הצללה מגבירה את החשיפה לאור השמש, ובכך מעלה את טמפרטורות היום בבית הגידול הטבעי של *Hypericum perforatum*, מה שתורם גם לעלייה בתפוקה של היפריצין. בהתבסס על נתונים אלה, מחקר זה חקר את תפקידם של חלקיקי ברזל ננו כמעוררים פוטנציאליים בתרבית רקמות. התוצאות הראו כי חלקיקים ננו אלה יכולים להפעיל גנים המעורבים בביוסינתזה של הספרידין באמצעות גירוי אנזימטי, מה שמוביל להצטברות מוגברת של תרכובת זו (איור 2). לכן, בהשוואה לצמחים הגדלים בתנאים טבעיים, ניתן לטעון כי ייצור תרכובות כאלה in vivo יכול להיות משופר גם כאשר עקה מתונה משולבת עם הפעלת גנים המעורבים בביוסינתזה של מטבוליטים משניים. טיפולים משולבים בדרך כלל משפיעים לטובה על קצב ההתחדשות, אך במקרים מסוימים, השפעה זו נחלשת. ראוי לציין כי טיפול ב-1 מ"ג/ליטר 2,4-D, 1.5 מ"ג/ליטר קינאז וריכוזים שונים יכלו להגדיל באופן עצמאי ומשמעותי את קצב ההתחדשות ב-50.85% בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 4c). תוצאות אלו מצביעות על כך ששילובים ספציפיים של ננו-הורמונים יכולים לפעול באופן סינרגטי כדי לקדם צמיחת צמחים וייצור מטבוליטים, דבר בעל משמעות רבה לתרבית רקמות של צמחי מרפא. פאלמר וקלר [50] הראו שטיפול ב-2,4-D יכול לגרום באופן עצמאי להיווצרות קאלוס ב-St. perforatum, בעוד שתוספת קינאז הגבירה משמעותית את היווצרות הקאלוס וההתחדשות. השפעה זו נבעה משיפור האיזון ההורמונלי ומגירוי חלוקת התאים. בל ועמיתיו [51] מצאו שטיפול ב-Fe₃O₄-NP יכול לשפר באופן עצמאי את תפקודם של אנזימים נוגדי חמצון, ובכך לקדם צמיחת שורשים ב-St. perforatum. מצע תרבית המכיל חלקיקי Fe₃O₄ ננומטריים בריכוזים של 0.5 מ"ג/ליטר, 1 מ"ג/ליטר ו-1.5 מ"ג/ליטר שיפר את קצב ההתחדשות של צמחי פשתן [52]. השימוש בננו-חלקיקי קינטין, 2,4-דיכלורובנזותיאזולינון וננו-חלקיקי Fe₃O₄ שיפר משמעותית את קצב היווצרות הקאלוס והשורשים, אולם יש לקחת בחשבון את תופעות הלוואי האפשריות של שימוש בהורמונים אלה לצורך התחדשות חוץ-גופית (in vitro). לדוגמה, שימוש ארוך טווח או בריכוז גבוה של 2,4-דיכלורובנזותיאזולינון או קינטין עלול לגרום לשונות שבטית סומטית, עקה חמצונית, מורפולוגיה חריגה של הקאלוס או ויטריפיקציה. לכן, קצב התחדשות גבוה אינו בהכרח מנבא יציבות גנטית. יש להעריך את כל הצמחים המתחדשים באמצעות סמנים מולקולריים (למשל RAPD, ISSR, AFLP) או ניתוח ציטוגנטי כדי לקבוע את ההומוגניות והדמיון שלהם לצמחים in vivo [53,54,55].
מחקר זה הדגים לראשונה כי השימוש המשולב בווסתי גדילה של צמחים (2,4-D וקינטין) עם ננו-חלקיקי Fe₃O₄ יכול לשפר את המורפוגנזה ואת הצטברות המטבוליטים הביולוגיים הפעילים (כולל היפריצין והיפרוזיד) בצמח *Hypericum perforatum*. משטר הטיפול האופטימלי (1 מ"ג/ליטר 2,4-D + 1 מ"ג/ליטר קינטין + 4 מ"ג/ליטר Fe₃O₄-NPs) לא רק הגדיל את היווצרות הקלוס, את האורגנוגנזה ואת תנובת המטבוליטים המשניים, אלא גם הדגים השפעה מעוררת קלה, שעשויה לשפר את סבילות הצמח ללחץ ואת הערך הרפואי שלו. השילוב של ננוטכנולוגיה ותרבית רקמות צמחיות מספק פלטפורמה בת קיימא ויעילה לייצור תרכובות רפואיות בקנה מידה גדול in vitro. תוצאות אלו סוללות את הדרך ליישומים תעשייתיים ולמחקר עתידי במנגנונים מולקולריים, אופטימיזציה של מינון ודיוק גנטי, ובכך מקשרות מחקר בסיסי על צמחי מרפא עם ביוטכנולוגיה מעשית.