צמיחת מריסטם אפיקלי (SAM) היא קריטית לארכיטקטורת גזע. הורמונים צמחייםג'יברלין(GAs) ממלאים תפקידי מפתח בתיאום צמיחת צמחים, אך תפקידם ב-SAM עדיין לא מובן. כאן, פיתחנו ביו-חיישן יחס של איתות GA על ידי הנדסת חלבון DELLA כדי לדכא את הפונקציה הרגולטורית החיונית שלו בתגובת התעתיק של GA תוך שמירה על השפלתו עם זיהוי GA. אנו מדגימים כי חיישן ביולוגי זה מבוסס השפלה מתעד במדויק שינויים ברמות GA ובחישה סלולרית במהלך הפיתוח. השתמשנו בחיישן הביולוגי הזה כדי למפות את פעילות איתות GA ב-SAM. אנו מראים שאותות GA גבוהים נמצאים בעיקר בתאים הממוקמים בין פרימורדיה של איברים, שהם מבשרים לתאי אינטרנוד. באמצעות גישות רווח ואובדן תפקוד, אנו מדגים עוד יותר ש-GA מסדיר את הכיוון של מישור חלוקת התא, מבסס את הארגון הסלולרי הקנוני של האינטרנודים, ובכך מקדם את מפרט ה-internode ב-SAM.
ה-SAM apical meristem (SAM), הממוקם בקודקוד היורה, מכיל נישה של תאי גזע שפעילותם יוצרת איברים צדדיים וצמתי גזע באופן מודולרי ואיטרטיבי לאורך חיי הצמח. כל אחת מהיחידות החוזרות הללו, או צמתות הצמח, כוללת פנימיות ואיברים צדדיים בצמתים, ומריסטמים ביתיים בציר העלים1. הצמיחה והארגון של צמתים צמחיים משתנים במהלך הפיתוח. ב- Arabidopsis, הצמיחה הפנימית מדוכאת בשלב הווגטטיבי, ומריסטמים ביתיים נשארים רדומים בציר עלי הרוזטה. במהלך המעבר לשלב הפרחוני, ה-SAM הופך למריסטם התפרחת, יוצר פנימיות מוארכות וניצני בית השחי, ענפים בציר של עלי צריבה, ומאוחר יותר, פרחים חסרי עלים2. למרות שעשינו התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים השולטים בהתחלת עלים, פרחים וענפים, מעט יחסית ידוע על האופן שבו נוצרות פנימיות.
הבנת ההתפלגות המרחבית-זמנית של GAs תעזור להבין טוב יותר את התפקודים של הורמונים אלה ברקמות שונות ובשלבי התפתחות שונים. הדמיה של השפלה של היתוך RGA-GFP המתבטאת בפעולת המקדם שלו מספקת מידע חשוב על ויסות רמות ה-GA הכוללות בשורשים15,16. עם זאת, ביטוי RGA משתנה בין רקמות17 ומוסדר על ידי GA18. לפיכך, ביטוי דיפרנציאלי של מקדם RGA עשוי לגרום לדפוס הקרינה הנצפה עם RGA-GFP ולכן שיטה זו אינה כמותית. לאחרונה, פלואורססאין ביו-אקטיבי (Fl) המסומן GA19,20 חשף הצטברות של GA באנדוקרטקס השורש ואת ויסות הרמות התאיות שלו על ידי הובלת GA. לאחרונה, חיישן GA FRET nlsGPS1 הראה שרמות GA מתואמות עם התארכות תאים בשורשים, חוטים ובהיפוקוטילים כהים21. עם זאת, כפי שראינו, ריכוז GA אינו הפרמטר היחיד השולט בפעילות איתות GA, מכיוון שהוא תלוי בתהליכי חישה מורכבים. כאן, בהתבסס על ההבנה שלנו לגבי מסלולי האיתות של DELLA ו-GA, אנו מדווחים על פיתוח ואפיון של ביו-חיישן יחס יחס מבוסס-השפלה לאיתות GA. כדי לפתח חיישן ביולוגי כמותי זה, השתמשנו ב-RGA רגיש ל-GA מוטנטי שהיה מאוחה לחלבון ניאון ובא לידי ביטוי בכל מקום ברקמות, כמו גם בחלבון ניאון שאינו רגיש ל-GA. אנו מראים שהתמזגות החלבון המוטנטיות של RGA אינן מפריעות לאיתות GA אנדוגני כשהן מתבטאות בכל מקום, וכי חיישן ביולוגי זה יכול לכמת פעילות איתות הנובעת הן מכניסת GA והן מעיבוד אותות GA על ידי מכשיר החישה ברזולוציה גבוהה מרחבית-זמנית. השתמשנו בחיישן הביולוגי הזה כדי למפות את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פעילות איתות GA ולכמת כיצד GA מווסת את ההתנהגות הסלולרית באפידרמיס SAM. אנו מדגימים כי GA מסדיר את הכיוון של מישור החלוקה של תאי SAM הממוקמים בין פרימורדיה של איברים, ובכך מגדיר את הארגון הסלולרי הקנוני של האינטרנודה.
לבסוף, שאלנו אם qmRGA יכול לדווח על שינויים ברמות GA אנדוגני באמצעות היפוקוטילים גדלים. הראינו בעבר שניטראט ממריץ צמיחה על ידי הגדלת סינתזת GA ובתמורה, פירוק DELLA34. בהתאם, ראינו שאורך ההיפוקוטיל בשתילי pUBQ10::qmRGA שגדלו באספקת חנקה בשפע (10 mM NO3-) היה ארוך משמעותית מזה שבשתילים שגדלו בתנאים חסרי חנקה (איור משלים. 6a). בהתאם לתגובת הצמיחה, אותות GA היו גבוהים יותר בהיפוקוטילים של שתילים שגדלו בתנאים של 10 mM NO3- מאשר בשתילים שגדלו בהיעדר חנקה (איור משלים. 6b, c). לפיכך, qmRGA מאפשר גם ניטור של שינויים באיתות GA הנגרמים על ידי שינויים אנדוגניים בריכוז GA.
כדי להבין האם פעילות האיתות של GA שזוהתה על ידי qmRGA תלויה בריכוז GA ובתפיסת GA, כצפוי בהתבסס על עיצוב החיישן, ניתחנו את הביטוי של שלושת קולטני GID1 ברקמות וגטטיביות ורבייה. בשתילים, קו הדיווח GID1-GUS הראה ש-GID1a ו-c באו לידי ביטוי גבוה בקוטילדונים (איור 3a-c). בנוסף, שלושת הקולטנים באו לידי ביטוי בעלים, בצמיחי השורש הצדדיים, בקצות השורשים (למעט כיפת השורש של GID1b) ובמערכת כלי הדם (איור 3a-c). ב-SAM של התפרחת, זיהינו אותות GUS רק עבור GID1b ו-1c (איור משלים 7a-c). הכלאה in situ אישרה דפוסי ביטוי אלו והדגימה עוד ש-GID1c בא לידי ביטוי אחיד ברמות נמוכות ב-SAM, בעוד ש-GID1b הראה ביטוי גבוה יותר בפריפריה של ה-SAM (איור משלים 7d-l). האיחוי התרגומי pGID1b::2xmTQ2-GID1b גילה גם טווח מדורג של ביטוי GID1b, מביטוי נמוך או ללא ביטוי במרכז ה-SAM ועד לביטוי גבוה בגבולות האיברים (איור משלים 7m). לפיכך, קולטני GID1 אינם מפוזרים באופן אחיד על פני הרקמות ובתוך הרקמות. בניסויים מאוחרים יותר, צפינו גם כי ביטוי יתר של GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) הגביר את הרגישות של qmRGA בהיפוקוטילים ליישום חיצוני של GA (איור 3d, e). לעומת זאת, פלואורסצנציה שנמדדה על ידי qd17mRGA בהיפוקוטיל לא הייתה רגישה לטיפול ב-GA3 (איור 3f, g). עבור שני הניסויים, השתילים טופלו בריכוזים גבוהים של GA (100 מיקרומולר GA3) כדי להעריך את ההתנהגות המהירה של החיישן, שבה היכולת להיקשר לקולטן GID1 שופרה או אבדה. יחד, תוצאות אלו מאשרות כי הביוסנסור qmRGA משרת פונקציה משולבת כ-GA ו-GA חיישן, ומרמזות כי ביטוי דיפרנציאלי של קולטן GID1 יכול לווסת באופן משמעותי את פליטת החיישן.
עד כה, התפלגות אותות GA ב-SAM נותרה לא ברורה. לכן, השתמשנו בצמחים המבטאים qmRGA ובמדווח תאי גזע pCLV3 ::mCherry-NLS35 כדי לחשב מפות כמותיות ברזולוציה גבוהה של פעילות איתות GA, תוך התמקדות בשכבת L1 (אפידרמיס; איור. 4a, ב, ראה שיטות ושיטות משלימות), מכיוון ש-L1 ממלא תפקיד מרכזי בצמיחה של SAM36. כאן, ביטוי pCLV3::mCherry-NLS סיפק נקודת התייחסות גיאומטרית קבועה לניתוח ההתפלגות המרחבית-זמנית של פעילות איתות GA37. למרות ש-GA נחשב חיוני להתפתחות איברים רוחביים4, ראינו שאותות GA היו נמוכים בפרימורד הפרחוני (P) החל משלב P3 (איור 4a, ב), בעוד שלפרימורדיום P1 ו-P2 צעירים הייתה פעילות מתונה דומה לזו שבאזור המרכזי (איור 4a, ב). פעילות איתות GA גבוהה יותר זוהתה בגבולות האיברים הפרימורדיים, החל מ-P1/P2 (בצידי הגבול) ושיא ב-P4, וכן בכל תאי האזור ההיקפי הממוקמים בין הפרימורדיה (איור 4a, b ואיור משלים 8a, b). פעילות איתות גבוהה יותר של GA נצפתה לא רק באפידרמיס אלא גם בשכבות L2 ו-L3 העליונות (איור משלים. 8b). הדפוס של אותות GA שזוהה ב-SAM באמצעות qmRGA גם הוא נותר ללא שינוי לאורך זמן (איור משלים. 8c–f, k). למרות שמבנה ה-qd17mRGA היה מווסת באופן שיטתי ב-SAM של צמחי T3 מחמישה קווים עצמאיים שאפיינו בפירוט, הצלחנו לנתח את דפוסי הקרינה שהתקבלו עם המבנה pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (איור משלים. 8g-j, l). בקו בקרה זה, רק שינויים קלים ביחס הקרינה זוהו ב-SAM, אך במרכז ה-SAM ראינו ירידה ברורה ובלתי צפויה ב-VENUS הקשורה ל-TagBFP. זה מאשר שדפוס האיתות שנצפה על ידי qmRGA משקף השפלה תלויה ב-GA של mRGA-VENUS, אך גם מדגים ש-qmRGA עשוי להעריך יתר על המידה את פעילות איתות GA במרכז המריסטם. לסיכום, התוצאות שלנו חושפות דפוס איתות GA שמשקף בעיקר את התפלגות הפרימורדיה. התפלגות זו של האזור הבין-ראשוני (IPR) נובעת מהתבססות הדרגתית של פעילות איתות GA גבוהה בין הפרימורדיום המתפתח לאזור המרכז, כאשר במקביל פעילות איתות ה-GA בפרימורדיום פוחתת (איור 4ג, ד).
ההתפלגות של קולטני GID1b ו-GID1c (ראה לעיל) מעידה על כך שביטוי דיפרנציאלי של קולטני GA עוזר לעצב את הדפוס של פעילות איתות GA ב-SAM. תהינו האם ייתכן שהצטברות דיפרנציאלית של GA מעורבת. כדי לחקור אפשרות זו, השתמשנו בחיישן nlsGPS1 GA FRET21. תדירות הפעלה מוגברת זוהתה ב-SAM של nlsGPS1 שטופלה ב-10 מיקרומטר GA4+7 למשך 100 דקות (איור משלים 9a-e), מה שמעיד על כך ש-nlsGPS1 מגיב לשינויים בריכוז GA ב-SAM, כפי שהוא עושה בשורשים21. התפלגות מרחבית של תדירות ההפעלה של nlsGPS1 חשפה רמות GA נמוכות יחסית בשכבות החיצוניות של ה-SAM, אך הראתה שהן מוגבהות במרכז ובגבולות ה-SAM (איור 4e ואיור משלים 9a,c). זה מצביע על כך ש-GA מופץ גם ב-SAM עם דפוס מרחבי דומה לזה שמתגלה על ידי qmRGA. כגישה משלימה, התייחסנו ל-SAM גם עם GA ניאון (GA3-, GA4-, GA7-Fl) או Fl בלבד כשליטה שלילית. האות Fl הופץ בכל ה-SAM, כולל האזור המרכזי והפרימורדיום, אם כי בעוצמה נמוכה יותר (איור 4j ואיור משלים. 10d). לעומת זאת, כל שלושת ה-GA-Fl הצטברו ספציפית בגבולות הפרימורדיום ובדרגות שונות בשאר ה-IPR, כאשר GA7-Fl הצטבר בתחום הגדול ביותר ב-IPR (איור 4k ואיור משלים 10a,b). כימות של עוצמת הקרינה גילה שיחס עוצמת ה-IPR לא-IPR היה גבוה יותר ב-SAM שטופלו ב-GA-Fl בהשוואה ל-SAM שטופלו ב-Fl (איור 4l ואיור משלים. 10c). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-GA קיים בריכוזים גבוהים יותר בתאי IPR הממוקמים הקרובים ביותר לגבול האיבר. זה מצביע על כך שהדפוס של פעילות איתות SAM GA נובע הן מביטוי דיפרנציאלי של קולטני GA והן מהצטברות דיפרנציאלית של GA בתאי IPR ליד גבולות האיברים. לפיכך, הניתוח שלנו חשף דפוס מרחבי-זמני בלתי צפוי של איתות GA, עם פעילות נמוכה יותר במרכז והפרימורדיום של ה-SAM ופעילות גבוהה יותר ב-IPR באזור הפריפריאלי.
כדי להבין את התפקיד של פעילות איתות GA דיפרנציאלית ב-SAM, ניתחנו את המתאם בין פעילות איתות GA, התרחבות תאים וחלוקת תאים באמצעות הדמיה בזמן אמת של SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. בהתחשב בתפקידו של GA בוויסות הצמיחה, היה צפוי מתאם חיובי עם פרמטרי התרחבות התא. לכן, השווינו תחילה מפות פעילות איתות של GA עם מפות של קצב צמיחת פני התא (כפרוקסי לחוזק התרחבות התא עבור תא נתון ולתאי בת בחלוקה) ועם מפות של אניזוטרופיה של גדילה, המודדת את כיווניות ההתרחבות של התא (משמשת כאן גם עבור תא נתון ועבור תאי בת בחלוקה; איור 5a,b, ראה שיטות ושיטות משלימות). המפות שלנו של קצב צמיחת פני התאים SAM תואמות לתצפיות קודמות38,39, עם שיעורי צמיחה מינימליים בגבול ושיעורי צמיחה מקסימליים בפרחים מתפתחים (איור 5א). ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) הראה שפעילות איתות GA הייתה בקורלציה שלילית עם עוצמת צמיחת פני התא (איור 5c). הראינו גם שצירי הווריאציה העיקריים, כולל קלט איתות GA ועוצמת הצמיחה, היו אורתוגונלים לכיוון שנקבע על ידי ביטוי CLV3 גבוה, מה שמאשר את ההדרה של תאים ממרכז SAM בניתוחים הנותרים. ניתוח המתאם של Spearman אישר את תוצאות ה-PCA (איור 5d), מה שמצביע על כך שאותות GA גבוהים יותר ב-IPR לא הביאו להתרחבות תאים גבוהה יותר. עם זאת, ניתוח מתאם גילה מתאם חיובי קל בין פעילות איתות GA ואנזיטרופיה של גדילה (איור 5c, d), מה שמרמז כי איתות GA גבוה יותר ב-IPR משפיע על כיוון צמיחת התא ואולי על המיקום של מישור חלוקת התא.
a, b מפות חום של גידול פני השטח הממוצע (א) ואנזיטרופיה של גדילה (ב) ב-SAM בממוצע על פני שבעה צמחים עצמאיים (המשמשים כפרוקסי לחוזק וכיוון התפשטות התא, בהתאמה). c ניתוח PCA כלל את המשתנים הבאים: אות GA, עוצמת צמיחת פני השטח, אניזוטרופיה של צמיחת פני השטח וביטוי CLV3. רכיב PCA 1 היה מתאם שלילי בעיקר עם עוצמת הצמיחה של פני השטח ומתאם חיובי עם אות GA. רכיב PCA 2 היה מתאם חיובי בעיקר עם אניזוטרופיה של צמיחת פני השטח ובקורלציה שלילית עם ביטוי CLV3. האחוזים מייצגים את הווריאציה המוסברת על ידי כל רכיב. ד ניתוח מתאם Spearman בין אות GA, עוצמת צמיחת פני השטח ואנזיטרופיה של צמיחת פני השטח בסולם הרקמה למעט CZ. המספר מימין הוא ערך Spearman rho בין שני משתנים. כוכביות מצביעות על מקרים שבהם המתאם/המתאם השלילי הוא משמעותי ביותר. הדמיה תלת מימדית של תאי Col-0 SAM L1 על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. קירות תאים חדשים שנוצרו ב-SAM (אך לא בפרימורדיום) ב-10 שעות נצבעים בהתאם לערכי הזווית שלהם. סרגל הצבעים מוצג בפינה הימנית התחתונה. התוספת מציגה את תמונת התלת-ממד המתאימה ב-0 שעות. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. f מגרשי קופסה מציגים שיעורי חלוקת תאים ב-IPR וב-IPR Col-0 SAM (n = 10 צמחים עצמאיים). הקו המרכזי מציג את החציון, וגבולות התיבה מציינים את האחוזון ה-25 וה-75. שפם מציין את ערכי המינימום והמקסימום שנקבעו עם תוכנת R. ערכי P התקבלו עם מבחן ה-t הדו-זנבתי של Welch. g, h דיאגרמה סכמטית המראה (g) כיצד למדוד את הזווית של דופן התא החדש (מגנטה) ביחס לכיוון הרדיאלי ממרכז ה-SAM (קו מנוקד לבן) (רק ערכי זווית חדה, כלומר 0-90°, נחשבים), ו-(ח) את הכיוונים ההיקפיים/לרוחבים והרדיאליים בתוך המריסטם. i היסטוגרמות תדר של כיוון מישור חלוקת התא על פני ה-SAM (כחול כהה), IPR (כחול בינוני) ו-non-IPR (תכלת), בהתאמה. ערכי P התקבלו במבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-זנבתי. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. j היסטוגרמות תדר של כיוון מישור חלוקת התא של ה-IPR סביב P3 (ירוק בהיר), P4 (ירוק בינוני) ו-P5 (ירוק כהה), בהתאמה. ערכי P התקבלו במבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-זנבתי. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות.
לכן, לאחר מכן חקרנו את המתאם בין איתות GA ופעילות חלוקת תאים על ידי זיהוי קירות תאים חדשים שנוצרו במהלך הבדיקה (איור 5ה). גישה זו אפשרה לנו למדוד את התדירות והכיוון של חלוקת התא. באופן מפתיע, מצאנו שתדירות חלוקת התאים ב-IPR ובשאר ה-SAM (לא IPR, איור 5f) הייתה דומה, מה שמעיד על כך שהבדלים באיתות GA בין תאי IPR לתאי שאינם IPR אינם משפיעים באופן משמעותי על חלוקת התא. זה, והמתאם החיובי בין איתות GA לאנזיטרופיה של גדילה, הניעו אותנו לשקול האם פעילות איתות GA יכולה להשפיע על הכיוון של מישור חלוקת התא. מדדנו את הכיוון של דופן התא החדש כזווית חדה ביחס לציר הרדיאלי המחבר בין מרכז המריסטם למרכז דופן התא החדש (איור 5e-i) וצפינו בנטייה ברורה של תאים להתחלק בזוויות הקרובות ל-90° ביחס לציר הרדיאלי, כאשר התדרים הגבוהים ביותר נצפו ב-08-08%-08% ו-20°. (22.62%) (איור 5e,i), המקביל לחלוקות תאים בכיוון היקפי/רוחבי (איור 5h). כדי לבחון את התרומה של איתות GA להתנהגות חלוקת תאים זו, ניתחנו בנפרד פרמטרים של חלוקת תאים ב-IPR ולא-IPR (איור 5i). ראינו שהתפלגות זווית החלוקה בתאי IPR שונה מזו בתאי IPR או בתאים בכל ה-SAM, כאשר תאי IPR מציגים שיעור גבוה יותר של חלוקות תאים לרוחב/מעגלי, כלומר, 70-80° ו-80-90° (33.86% ו-30.71%, בהתאמה, 5, בהתאמה). לפיכך, התצפיות שלנו חשפו קשר בין איתות GA גבוה לבין אוריינטציה של מישור חלוקת תאים קרוב לכיוון ההיקפי, בדומה למתאם בין פעילות איתות GA לאנזיטרופיה של גדילה (איור 5c, ד). כדי לבסס עוד יותר את השימור המרחבי של הקשר הזה, מדדנו את כיוון מישור החלוקה בתאי IPR המקיפים את הפרימורדיום החל מ-P3, מכיוון שפעילות האיתות הגבוהה ביותר של GA זוהתה באזור זה החל מ-P4 (איור 4). זוויות החלוקה של ה-IPR סביב P3 ו-P4 לא הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית, אם כי נצפתה תדירות מוגברת של חלוקות תאים לרוחב ב-IPR סביב P4 (איור 5j). עם זאת, בתאי IPR סביב P5, ההבדל באוריינטציה של מישור חלוקת התא הפך למשמעותי סטטיסטית, עם עלייה חדה בתדירות חלוקת התאים הרוחבית (איור 5j). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שאיתות GA יכול לשלוט על האוריינטציה של חלוקות תאים ב-SAM, מה שעולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים40,41 כי איתות GA גבוה יכול לגרום לכיוון רוחבי של חלוקות תאים ב-IPR.
ההערכה היא שתאים ב-IPR לא ישולבו בפרימורדיה אלא באינטרנודים2,42,43. הכיוון הרוחבי של חלוקות תאים ב-IPR עשוי לגרום לארגון טיפוסי של שורות אורך מקבילות של תאי אפידרמיס באינטרנודים. התצפיות שלנו שתוארו לעיל מצביעות על כך שסביר להניח שאיתות GA ממלא תפקיד בתהליך זה על ידי ויסות כיוון חלוקת התא.
אובדן תפקוד של מספר גנים של DELLA מביא לתגובת GA מכוננת, וניתן להשתמש במוטציות דלה כדי לבדוק השערה זו44. תחילה ניתחנו את דפוסי הביטוי של חמישה גנים של DELLA ב-SAM. היתוך תעתיק של קו GUS45 גילה ש-GAI, RGA, RGL1 ו-RGL2 (במידה פחותה הרבה יותר) באו לידי ביטוי ב-SAM (איור משלים. 11a-d). הכלאה באתרו הדגימה עוד ש-GAI mRNA מצטבר במיוחד בפרימודיה ובפרחים מתפתחים (איור משלים. 11e). RGL1 ו-RGL3 mRNA זוהו לאורך חופת SAM ובפרחים מבוגרים יותר, בעוד ש- RGL2 mRNA היה בשפע באזור הגבול (איור משלים. 11f-h). הדמיה קונפוקלית של pRGL3::RGL3-GFP SAM אישרה את הביטוי שנצפה על ידי הכלאה באתרו והראתה שחלבון RGL3 מצטבר בחלק המרכזי של ה-SAM (איור משלים. 11i). באמצעות קו pRGA::GFP-RGA, מצאנו גם שחלבון RGA מצטבר ב-SAM, אך השפע שלו פוחת בגבול החל מ-P4 (איור משלים. 11j). יש לציין כי דפוסי הביטוי של RGL3 ו-RGA תואמים לפעילות איתות GA גבוהה יותר ב-IPR, כפי שזוהה על ידי qmRGA (איור 4). יתרה מכך, נתונים אלו מצביעים על כך שכל ה-DELLAs באים לידי ביטוי ב-SAM וכי הביטוי שלהם משתרע ביחד על כל ה-SAM.
לאחר מכן ניתחנו את פרמטרי חלוקת התא ב-SAM מסוג פראי (Ler, בקרה) וב-gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 דלה חמישיות (גלובליות) מוטציות (איור 6a, ב). מעניין לציין שצפינו בשינוי מובהק סטטיסטית בהתפלגות תדרי זווית חלוקת התא ב-SAM המוטנטי העולמי של דלה בהשוואה לסוג הבר (איור 6c). שינוי זה במוטנט דלה גלובלי נבע מעלייה בתדירות של זוויות של 80-90° (34.71% לעומת 24.55%) ובמידה פחותה, זוויות של 70-80° (23.78% לעומת 20.18%), כלומר תואמות לחלוקות תאים רוחביות 6 (Fig.c). התדירות של חלוקות לא רוחביות (0-60°) הייתה נמוכה יותר גם במוטנט הדלה העולמי (איור 6c). התדירות של חלוקות תאים רוחביות גדלה באופן משמעותי ב-SAM של המוטנט הגלובלי דלה (איור 6b). התדירות של חלוקות תאים רוחביות ב-IPR הייתה גבוהה יותר גם ב-della global mutant בהשוואה לסוג הבר (איור 6d). מחוץ לאזור ה-IPR, לסוג הבר היה חלוקה אחידה יותר של זוויות חלוקת התא, בעוד שהמוטנט הגלובלי של הדלה העדיף חלוקות משיקיות כמו ה-IPR (איור 6ה). כמו כן, כימתנו את האוריינטציה של חלוקות תאים ב-SAM של חמישה מוטנטים של ga2 אוקסידאז (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 ו-ga2ox6-2), רקע מוטנטי שאינו פעיל ב-GA שבו GA מצטבר. בהתאם לעלייה ברמות ה-GA, ה-SAM של התפרחת המוטנטית החמישית ga2ox היה גדול יותר מזה של Col-0 (איור משלים. 12a, b), ובהשוואה ל-Col-0, ה-SAM החמישית ga2ox הראה התפלגות שונה באופן מובהק של זוויות חלוקת התא, כאשר התדירות הזווית 500° גוברת שוב מזווית 500°. חלוקות (איור משלים 12א–ג). לפיכך, אנו מראים שהפעלה מכוננת של איתות GA והצטברות GA גורמים לחלוקות תאים לרוחב ב-IPR ובשאר ה-SAM.
a, b הדמיה תלת מימדית של שכבת L1 של Ler מוכתם ב-PI (א) ודלה מוטציה גלובלית (ב) SAM באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. קירות תאים חדשים שנוצרו ב-SAM (אך לא בפרימורדיום) במשך תקופה של 10 שעות מוצגים ונצבעים בהתאם לערכי הזווית שלהם. ההוספה מציגה את ה-SAM בשעה 0. סרגל הצבעים מוצג בפינה הימנית התחתונה. החץ ב-(ב) מצביע על דוגמה של קבצי תאים מיושרים במוטנט הדלה העולמי. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. ce השוואה של התפלגות התדרים של כיווני מישור חלוקת התא בכל ה-SAM (d), IPR (e) ו-non-IPR (f) בין Ler לדלה העולמית. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-זנבי. f, g הדמיה תלת מימדית של תמונות קונפוקאליות של SAM מוכתם ב-PI של צמחים מהונדסים של Col-0 (i) ו-pCUC2::gai-1-VENUS (j). לוחות (א, ב) מציגים קירות תאים חדשים (אך לא פרימורדיה) שנוצרו ב-SAM תוך 10 שעות. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. h–j השוואה של התפלגות התדרים של כיווני מישור חלוקת תאים הממוקמים בכל ה-SAM (h), IPR (i) ולא-IPR (j) בין צמחי Col-0 ו-pCUC2::gai-1-VENUS. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-זנבי.
לאחר מכן בדקנו את ההשפעה של עיכוב איתות GA באופן ספציפי ב-IPR. לשם כך, השתמשנו בפרומוטר של cotyledon cup 2 (CUC2) כדי להניע את הביטוי של חלבון gai-1 שלילי דומיננטי המחובר ל-VENUS (בקו pCUC2::gai-1-VENUS). ב-SAM מהסוג הבר, הפרומוטר של CUC2 מניע את הביטוי של רוב ה-IPRs ב-SAM, כולל תאי גבול, מ-P4 ואילך, וביטוי ספציפי דומה נצפה בצמחי pCUC2::gai-1-VENUS (ראה להלן). התפלגות זוויות חלוקת התאים על פני ה-SAM או ה-IPR של צמחי pCUC2::gai-1-VENUS לא הייתה שונה באופן משמעותי מזו של הסוג הבר, אם כי באופן בלתי צפוי מצאנו שתאים ללא IPR בצמחים אלה התחלקו בתדירות גבוהה יותר של 80-90° (איור 6f-j).
הוצע כי כיוון חלוקת התא תלוי בגיאומטריה של ה-SAM, במיוחד במתח המתיחה שנוצר על ידי עקמומיות הרקמה46. לכן שאלנו האם צורת ה-SAM השתנתה בצמחי הדלה הגלובאליים ובצמחי pCUC2::gai-1-VENUS. כפי שדווח בעבר12, גודלו של המוטציה הגלובלית של דלה SAM היה גדול יותר מזה של סוג הבר (איור משלים. 13a, b, d). הכלאה באתרו של CLV3 ו- STM RNA אישרה את התרחבות המריסטם במוטנטים דלה והראתה עוד את ההתרחבות הצידית של נישת תאי הגזע (איור משלים. 13e, f, h, i). עם זאת, עקמומיות SAM הייתה דומה בשני הגנוטיפים (איור משלים 13k, m, n, p). ראינו עלייה דומה בגודל במוטנט gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della מרובע ללא שינוי בעקמומיות בהשוואה לסוג הבר (איור משלים. 13c, d, g, j, l, o, p). תדירות אוריינטציה של חלוקת התא הושפעה גם במוטנט דלה מרובע, אך במידה פחותה מאשר במוטנט הדלה המונוליטי (איור משלים. 12d-f). אפקט מינון זה, יחד עם היעדר השפעה על עקמומיות, מצביע על כך שפעילות RGL3 שיורית במוטנט המרובע של Della מגבילה שינויים בכיוון חלוקת התא הנגרמים על ידי אובדן פעילות DELLA וכי שינויים בחלוקות תאים לרוחב מתרחשים בתגובה לשינויים בפעילות איתות GA ולא לשינויים בגיאומטריית SAM. כפי שתואר לעיל, מקדם CUC2 מניע את ביטוי IPR ב-SAM החל מ-P4 (איור משלים. 14a, b), ולעומת זאת, ל-pCUC2::gai-1-VENUS SAM היה גודל מופחת אך עקמומיות גבוהה יותר (איור משלים. 14c-h). שינוי זה במורפולוגיה של pCUC2::gai-1-VENUS SAM עשוי לגרום לפיזור שונה של מתחים מכניים בהשוואה לסוג הבר, שבו מתחים היקפיים גבוהים מתחילים במרחק קצר יותר ממרכז SAM47. לחלופין, השינויים במורפולוגיה של pCUC2::gai-1-VENUS SAM עשויים לנבוע משינויים בתכונות מכניות אזוריות שנגרמו על ידי ביטוי טרנסגן48. בשני המקרים, זה יכול לקזז חלקית את ההשפעות של שינויים באיתות GA על ידי הגדלת הסבירות שתאים יתחלקו בכיוון היקפי/רוחבי, מה שמסביר את התצפיות שלנו.
יחד, הנתונים שלנו מאשרים כי איתות GA גבוה יותר ממלא תפקיד פעיל בכיוון הרוחבי של מישור חלוקת התא ב-IPR. הם גם מראים כי עקמומיות מריסטם משפיעה גם על הכיוון של מישור חלוקת התא ב-IPR.
האוריינטציה הרוחבית של מישור החלוקה ב-IPR, עקב פעילות איתות גבוהה של GA, מעידה על כך ש-GA מארגן מראש קובץ תאים רדיאלי באפידרמיס בתוך ה-SAM כדי להגדיר את הארגון הסלולרי שיימצא מאוחר יותר באינטרנוד האפידרמיס. ואכן, קבצי תאים כאלה נראו לעתים קרובות בתמונות SAM של מוטציות דלה גלובליות (איור 6b). לפיכך, כדי להמשיך ולחקור את הפונקציה ההתפתחותית של הדפוס המרחבי של איתות GA ב-SAM, השתמשנו בהדמיית זמן-lapse כדי לנתח את הארגון המרחבי של תאים ב-IPR בסוג פראי (Ler ו-Col-0), מוטנטים דלה גלובליים וצמחים מהונדסים pCUC2::gai-1-VENUS.
מצאנו ש-qmRGA הראה שפעילות איתות GA ב-IPR עלתה מ-P1/P2 והגיעה לשיא ב-P4, ודפוס זה נשאר קבוע לאורך זמן (איור 4a-f ואיור משלים. 8c-f, k). כדי לנתח את הארגון המרחבי של תאים ב-IPR עם אות GA הולך וגובר, סימנו תאי Ler IPR מעל ולצדדים של P4 בהתאם לגורלם ההתפתחותי שלהם מנותח 34 שעות לאחר התצפית הראשונה, כלומר, יותר משני פעמים פלסטידיות, מה שמאפשר לנו לעקוב אחר תאי IPR במהלך התפתחות פרימורדיום מ-P1/P2 ל-P4. השתמשנו בשלושה צבעים שונים: צהוב עבור אותם תאים ששולבו בפרימורדיום ליד P4, ירוק עבור אלה שהיו ב-IPR, וסגול עבור אלה שהשתתפו בשני התהליכים (איור 7a-c). בשעה t0 (0 שעות), 1-2 שכבות של תאי IPR נראו לפני P4 (איור 7א). כצפוי, כאשר תאים אלו התחלקו, הם עשו זאת בעיקר דרך מישור החלוקה הרוחבית (איורים 7a–c). תוצאות דומות התקבלו באמצעות Col-0 SAM (התמקדות ב-P3, שגבולו מתקפל בדומה ל-P4 ב-Ler), למרות שבגנוטיפ זה הקפל שנוצר בגבול הפרחוני הסתיר את תאי ה-IPR מהר יותר (איור 7g-i). לפיכך, דפוס החלוקה של תאי IPR מארגן מראש את התאים לשורות רדיאליות, כמו באינטרנודים. הארגון של שורות רדיאליות והלוקליזציה של תאי IPR בין איברים עוקבים מעידים על כך שתאים אלה הם אבות פנימיים.
כאן, פיתחנו ביו-חיישן איתות GA ratiometric, qmRGA, המאפשר מיפוי כמותי של פעילות איתות GA הנובעת מריכוזים משולבים של קולטני GA ו-GA תוך מזעור הפרעות למסלולי איתות אנדוגניים, ובכך לספק מידע על תפקוד GA ברמה התאית. לשם כך, בנינו חלבון DELLA שונה, mRGA, שאיבד את היכולת לקשור את שותפי האינטראקציה של DELLA אך נותר רגיש לפרוטוליזה המושרה על ידי GA. qmRGA מגיב הן לשינויים אקסוגניים והן לשינויים אנדוגניים ברמות GA, ותכונות החישה הדינמיות שלו מאפשרות הערכה של שינויים מרחבי-זמניים בפעילות איתות GA במהלך הפיתוח. qmRGA הוא גם כלי גמיש מאוד שכן ניתן להתאים אותו לרקמות שונות על ידי שינוי האמרגן המשמש לביטוי שלו (במידת הצורך), ובהתחשב באופי השמור של מסלול האיתות GA ומוטיב PFYRE על פני אנגיוספרים, סביר להניח שהוא ניתן להעברה למינים אחרים22. בהתאם לכך, מוטציה מקבילה בחלבון האורז SLR1 DELLA (HYY497AAA) הוכחה גם מדכאת את פעילות מדכא הגדילה של SLR1 תוך הפחתה קלה בלבד של השפלה בתיווך GA, בדומה ל-mRGA23. יש לציין כי מחקרים עדכניים בארבידופסיס הראו שמוטציה בודדת של חומצת אמינו בתחום PFYRE (S474L) שינתה את פעילות התעתיק של RGA מבלי להשפיע על יכולתו לקיים אינטראקציה עם שותפים של גורמי שעתוק50. למרות שמוטציה זו קרובה מאוד ל-3 החלפות חומצות אמינו הקיימות ב-mRGA, המחקרים שלנו מראים ששתי המוטציות הללו משנות מאפיינים ברורים של DELLA. למרות שרוב שותפי גורמי התעתוק נקשרים לתחומים LHR1 ו-SAW של DELLA26,51, כמה חומצות אמינו משומרות בתחום PFYRE עשויות לסייע בייצוב אינטראקציות אלו.
פיתוח פנימי הוא תכונה מרכזית בארכיטקטורת צמחים ושיפור התפוקה. qmRGA חשף פעילות איתות GA גבוהה יותר בתאי אבות IPR internode. על ידי שילוב של הדמיה כמותית וגנטיקה, הראינו שדפוסי איתות של GA מציפים מישורי חלוקת תאים מעגליים/רוחביים באפידרמיס SAM, ומעצבים את ארגון חלוקת התא הנדרש לפיתוח פנימי. מספר מווסתים של אוריינטציה של מישור חלוקת התא זוהו במהלך הפיתוח52,53. העבודה שלנו מספקת דוגמה ברורה לאופן שבו פעילות איתות GA מווסתת את הפרמטר הסלולרי הזה. DELLA יכול לקיים אינטראקציה עם קומפלקסים של חלבון מתקפלים מראש41, כך שאיתות GA עשוי לווסת את אוריינטציה של מישור חלוקת התא על ידי השפעה ישירה על אוריינטציה של מיקרו-צינוריות קליפת המוח40,41,54,55. הראינו באופן בלתי צפוי שב-SAM, המתאם של פעילות איתות גבוהה יותר של GA לא היה התארכות או חלוקה של תאים, אלא רק אניזוטרופיה של גדילה, מה שעולה בקנה אחד עם השפעה ישירה של GA על כיוון חלוקת התא ב-IPR. עם זאת, איננו יכולים לשלול שהשפעה זו יכולה להיות גם עקיפה, למשל בתיווך על ידי ריכוך דופן התא המושרה על ידי GA56. שינויים במאפייני דופן התא גורמים ללחץ מכני57,58, אשר יכול גם להשפיע על הכיוון של מישור חלוקת התא על ידי השפעה על האוריינטציה של microtubules קליפת המוח39,46,59. ההשפעות המשולבות של מתח מכני המושרה על ידי GA וויסות ישיר של אוריינטציה של מיקרו-צינוריות על ידי GA עשויות להיות מעורבות ביצירת דפוס ספציפי של אוריינטציה של חלוקת תאים ב-IPR כדי להגדיר פנימיות, ויש צורך במחקרים נוספים כדי לבדוק רעיון זה. באופן דומה, מחקרים קודמים הדגישו את חשיבותם של חלבוני האינטראקציה עם DELLA TCP14 ו-15 בבקרת היווצרות האינטרנודות60,61 וגורמים אלו עשויים לתווך את פעולת GA יחד עם BREVIPEDICELLUS (BP) ו-PENNYWISE (PNY), אשר מווסתים את התפתחות האינטרנודים והוכחו כמשפיעים על איתות 62GA. בהתחשב בכך ש-DELLAs מקיימים אינטראקציה עם מסלולי איתות של בראסינוסטרואידים, אתילן, חומצה יסמונית וחומצה אבסקיסית (ABA)63,64 ושההורמונים הללו יכולים להשפיע על כיוון המיקרוטובוליות65, ההשפעות של GA על אוריינטציה של חלוקת התא עשויות להיות מתווך גם על ידי הורמונים אחרים.
מחקרים ציטולוגיים מוקדמים הראו כי הן האזורים הפנימיים והחיצוניים של Arabidopsis SAM נדרשים לפיתוח אינטרנוד2,42. העובדה ש-GA מווסת באופן פעיל את חלוקת התאים ברקמות הפנימיות12 תומכת בתפקוד כפול של GA בוויסות גודל המריסטם והאינטרנוד ב-SAM. דפוס חלוקת התאים הכיוונית מווסת היטב גם ברקמת SAM הפנימית, וויסות זה חיוני לצמיחת גזע52. מעניין יהיה לבחון האם ל-GA תפקיד גם בהכוונת מישור חלוקת התא בארגון ה-SAM הפנימי, ובכך מסנכרן את המפרט והפיתוח של אינטרנודים בתוך ה-SAM.
צמחים גודלו במבחנה באדמה או 1x מדיום Murashige-Skoog (MS) (Duchefa) בתוספת של 1% סוכרוז ו-1% אגר (Sigma) בתנאים סטנדרטיים (16 שעות אור, 22 מעלות צלזיוס), למעט ניסויים של hypocotyl ושורשים שבהם גודלו שתילים על צלחות אנכיות באור קבוע ו-22 מעלות צלזיוס. עבור ניסויי חנקה, צמחים גודלו על מדיום MS שונה (מדיום צמחי bioWORLD) בתוספת חנקה נאותה (0 או 10 מ"מ KNO3), 0.5 מ"מ NH4-סוקסינאט, 1% סוכרוז ו-1% A-אגר (Sigma) בתנאים של ימים ארוכים.
GID1a cDNA שהוכנס ל-pDONR221 שולב מחדש עם pDONR P4-P1R-pUBQ10 ו-pDONR P2R-P3-mCherry לתוך pB7m34GW כדי ליצור pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA IDD2 שהוכנס ל-pDONR221 שולב מחדש לתוך pB7RWG266 כדי ליצור p35S:IDD2-RFP. כדי ליצור pGID1b::2xmTQ2-GID1b, קטע של 3.9 kb במעלה הזרם של אזור הקידוד של GID1b ומקטע של 4.7 kb המכיל את ה-GID1b cDNA (1.3 kb) והטרמינטור (3.4 kb) הוגברו תחילה באמצעות הפריימרים ב-pRmo המשלים בטבלה 43 ולאחר מכן ב-pRmo. Fisher Scientific) ו-pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), בהתאמה, ולבסוף שולבו מחדש עם pDONR221 2xmTQ268 לתוך וקטור היעד pGreen 012567 באמצעות שיבוט Gateway. כדי ליצור pCUC2::LSSmOrange, רצף המקדמים CUC2 (3229 bp במעלה הזרם של ATG) ואחריו רצף הקידוד של mOrange גדול שעבר סטוקס (LSSmOrange)69 עם אות הלוקליזציה הגרעיני N7 ו-NOS terminator שעתוק הורכבו לתוך מערכת ה-pGreen-fgmentation targeting kanamybin-pGreenway. (אינוויטרוגן). הווקטור הצמחי הבינארי הוכנס לתוך זן Agrobacterium tumefaciens GV3101 והוחדר לעלי Nicotiana benthamiana בשיטת החדירה של Agrobacterium ולתוך Arabidopsis thaliana Col-0 בשיטת טבילה פרחונית, בהתאמה. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ו-pCLV3::mCherry-NLS qmRGA בודדו מהצאצאים F3 ו-F1 של ההצלבות המתאימים, בהתאמה.
הכלאה של RNA באתרו בוצעה על קצות יורה באורך של כ-1 ס"מ 72, אשר נאספו וקבועים מיד בתמיסת FAA (3.7% פורמלדהיד, 5% חומצה אצטית, 50% אתנול) מקורר מראש ל-4 מעלות צלזיוס. לאחר טיפולי ואקום של 2 × 15 דקות, המקבע הוחלף ודגימות הודגרו למשך הלילה. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ו-RGL3 cDNAs ובדיקות אנטי-סנס ל-3'-UTRs שלהם סונתזו באמצעות הפריימרים המוצגים בטבלה משלימה 3 כפי שתואר על ידי Rosier et al.73. בדיקות המסומנות דיגוקסיגנין זוהו באמצעות נוגדני דיגוקסיגנין (דילול פי 3000; Roche, מספר קטלוגי: 11 093 274 910), וחתכים נצבעו ב-5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250-fee diazolnieturt) פתרון של פי 200).
זמן פרסום: 10-2-2025