ביוסנסור כמותי של גיברלין חושף את תפקידם של הגיברלינים במפרט פנימי במריסטם האפיקלי של הנצרה

צמיחת מריסטם אפיקלי של נבטים (SAM) היא קריטית לארכיטקטורת הגבעול. הורמוני צמחיםג'יברליניםלתאים מסוג GA (GAs) תפקידים מרכזיים בתיאום צמיחת צמחים, אך תפקידם בתאי הגדילה הגנטיים (SAM) נותר אינו מובן היטב. כאן, פיתחנו ביוסנסור רציומטרי של איתות GA על ידי הנדסת חלבון DELLA כך שידכא את תפקודו הרגולטורי החיוני בתגובת התעתוק של GA תוך שמירה על פירוקו לאחר זיהוי GA. אנו מדגימים כי ביוסנסור מבוסס פירוק זה מתעד במדויק שינויים ברמות GA ובחישה תאית במהלך ההתפתחות. השתמשנו בביוסנסור זה כדי למפות את פעילות איתות GA ב-SAM. אנו מראים כי אותות GA גבוהים קיימים בעיקר בתאים הממוקמים בין תאי גדילה של איברים, שהם קודמנים לתאי פנימיות. באמצעות גישות של רווח ואיבוד תפקוד, אנו מדגימים עוד כי GA מווסת את כיוון מישור חלוקת התא, ומבסס את הארגון התאי הקנוני של תאי הפנימיות, ובכך מקדם מפרט פנימיות ב-SAM.
המריסטמה האפיקלית של הנצרה (SAM), הממוקמת בקודקוד הנצרה, מכילה נישה של תאי גזע שפעילותם יוצרת איברים רוחביים ובלוטות גזע באופן מודולרי ואיטרטיבי לאורך חיי הצמח. כל אחת מיחידות חוזרות אלה, או צמתים צמחיים, כוללת פנימיים ואיברים רוחביים בצמתים, ומריסטמות בית שחי בחיקי העלים. הצמיחה והארגון של בלוטות הצמח משתנים במהלך ההתפתחות. בארבידופסיס, הצמיחה הפנימית מדוכאת במהלך השלב הווגטטיבי, והמריסטמות בבית השחי נשארות רדומות בחיקי עלי השושנה. במהלך המעבר לשלב הפריחה, ה-SAM הופך למריסטמה של התפרחת, ויוצר פנימיים מוארכים וניצני בית שחי, ענפים בחיקי עלי הכרובית, ומאוחר יותר, פרחים חסרי עלים. למרות שעשינו התקדמות משמעותית בהבנת המנגנונים השולטים ביצירת עלים, פרחים וענפים, מעט יחסית ידוע על אופן היווצרותם של פנימיים.
הבנת ההתפלגות המרחבית-זמנית של גזע תאים (GAs) תעזור להבין טוב יותר את תפקידי הורמונים אלה ברקמות שונות ובשלבי התפתחות שונים. ויזואליזציה של פירוק היתוך RGA-GFP המתבטא תחת פעולת הפרומוטר שלו מספקת מידע חשוב על ויסות רמות ה-GA הכוללות בשורשים15,16. עם זאת, ביטוי RGA משתנה בין רקמות17 ומווסת על ידי GA18. לכן, ביטוי דיפרנציאלי של הפרומוטר RGA עשוי לגרום לדפוס הפלואורסצנציה שנצפה עם RGA-GFP ולכן שיטה זו אינה כמותית. לאחרונה, GA המסומן בפלואורסצאין (Fl) ביו-אקטיבי19,20 חשף את הצטברות ה-GA באנדוקורטקס השורש ואת ויסות רמות התאים שלו על ידי הובלת GA. לאחרונה, חיישן ה-GA FRET nlsGPS1 הראה שרמות GA מתואמות עם התארכות תאים בשורשים, סיבים והיפוקוטילים כהים21. עם זאת, כפי שראינו, ריכוז GA אינו הפרמטר היחיד השולט בפעילות איתות GA, מכיוון שהוא תלוי בתהליכי חישה מורכבים. כאן, בהתבסס על הבנתנו את מסלולי האיתות DELLA ו-GA, אנו מדווחים על פיתוח ואפיון של ביוסנסור רציומטרי מבוסס פירוק לאיתות GA. כדי לפתח ביוסנסור כמותי זה, השתמשנו ב-RGA מוטנטי רגיש ל-GA אשר הותך לחלבון פלואורסצנטי ובא לידי ביטוי באופן נרחב ברקמות, כמו גם בחלבון פלואורסצנטי שאינו רגיש ל-GA. אנו מראים כי היתוכים של חלבוני RGA מוטנטיים אינם מפריעים לאיתות GA אנדוגני כאשר הם באים לידי ביטוי באופן נרחב, וכי ביוסנסור זה יכול לכמת את פעילות האיתות הנובעת הן מקלט GA והן מעיבוד אותות GA על ידי מנגנון החישה ברזולוציה מרחבית-זמנית גבוהה. השתמשנו בביו-סנסור זה כדי למפות את ההתפלגות המרחבית-זמנית של פעילות איתות GA ולכמת כיצד GA מווסת את התנהגות התאים באפידרמיס SAM. אנו מדגימים כי GA מווסת את כיוון מישור החלוקה של תאי SAM הממוקמים בין פרימורדיה של איברים, ובכך מגדירים את הארגון התאי הקנוני של הפנימיה.
לבסוף, שאלנו האם qmRGA יכול לדווח על שינויים ברמות GA אנדוגניות באמצעות היפוקוטילים הגדלים. בעבר הראינו כי ניטרט מגרה צמיחה על ידי הגברת סינתזת GA, ובתורו, פירוק DELLA34. בהתאם, צפינו שאורך ההיפוקוטיל בשתילים של pUBQ10::qmRGA שגודלו תחת אספקה ​​​​שופעת ניטרט (10 mM NO3−) היה ארוך משמעותית מזה של שתילים שגודלו בתנאים של חסר ניטרט (איור משלים 6a). בהתאם לתגובת הצמיחה, אותות GA היו גבוהים יותר בהיפוקוטילים של שתילים שגודלו בתנאי 10 mM NO3− מאשר בשתילים שגודלו בהיעדר ניטרט (איור משלים 6b, c). לפיכך, qmRGA מאפשר גם ניטור של שינויים באיתות GA הנגרמים על ידי שינויים אנדוגניים בריכוז GA.
כדי להבין האם פעילות האיתות של GA שזוהתה על ידי qmRGA תלויה בריכוז GA ובתפיסת GA, כצפוי בהתבסס על עיצוב החיישן, ניתחנו את הביטוי של שלושת קולטני GID1 ברקמות וגטטיביות ורבייה. בשתילים, קו הדיווח GID1-GUS הראה ש-GID1a ו-c באו לידי ביטוי גבוה בקוטילדונים (איור 3a-c). בנוסף, שלושת הקולטנים באו לידי ביטוי בעלים, בצמיחי השורש הצדדיים, בקצות השורשים (למעט כיפת השורש של GID1b) ובמערכת כלי הדם (איור 3a-c). ב-SAM של התפרחת, זיהינו אותות GUS רק עבור GID1b ו-1c (איור משלים 7a-c). הכלאה in situ אישרה דפוסי ביטוי אלו והדגימה עוד ש-GID1c בא לידי ביטוי אחיד ברמות נמוכות ב-SAM, בעוד ש-GID1b הראה ביטוי גבוה יותר בפריפריה של ה-SAM (איור משלים 7d-l). האיחוי התרגומי pGID1b::2xmTQ2-GID1b גילה גם טווח מדורג של ביטוי GID1b, מביטוי נמוך או ללא ביטוי במרכז ה-SAM ועד לביטוי גבוה בגבולות האיברים (איור משלים 7m). לפיכך, קולטני GID1 אינם מפוזרים באופן אחיד על פני הרקמות ובתוך הרקמות. בניסויים מאוחרים יותר, צפינו גם כי ביטוי יתר של GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) הגביר את הרגישות של qmRGA בהיפוקוטילים ליישום חיצוני של GA (איור 3d, e). לעומת זאת, פלואורסצנציה שנמדדה על ידי qd17mRGA בהיפוקוטיל לא הייתה רגישה לטיפול ב-GA3 (איור 3f, g). עבור שני הניסויים, השתילים טופלו בריכוזים גבוהים של GA (100 מיקרומולר GA3) כדי להעריך את ההתנהגות המהירה של החיישן, שבה היכולת להיקשר לקולטן GID1 שופרה או אבדה. יחד, תוצאות אלו מאשרות כי הביוסנסור qmRGA משרת פונקציה משולבת כ-GA ו-GA חיישן, ומרמזות כי ביטוי דיפרנציאלי של קולטן GID1 יכול לווסת באופן משמעותי את פליטת החיישן.
עד היום, התפלגות אותות GA ב-SAM נותרה לא ברורה. לכן, השתמשנו בצמחים המבטאים qmRGA ובמדוח תאי גזע pCLV3::mCherry-NLS כדי לחשב מפות כמותיות ברזולוציה גבוהה של פעילות איתות GA, תוך התמקדות בשכבת L1 (האפידרמיס; איור 4a, b, ראה שיטות ושיטות משלימות), מכיוון של-L1 תפקיד מפתח בבקרת בגדילת SAM. כאן, ביטוי pCLV3::mCherry-NLS סיפק נקודת ייחוס גיאומטרית קבועה לניתוח ההתפלגות המרחבית-זמנית של פעילות איתות GA. למרות ש-GA נחשב חיוני להתפתחות איברים רוחביים, צפינו שאותות GA היו נמוכים בפרימורדיום הפרחוני (P) החל משלב P3 (איור 4a, b), בעוד שלפרימורדיומים צעירים של P1 ו-P2 הייתה פעילות בינונית בדומה לזו באזור המרכזי (איור 4a, b). פעילות איתות GA גבוהה יותר זוהתה בגבולות פרימורדיום האיברים, החל מ-P1/P2 (בצידי הגבול) והגיעה לשיאה ב-P4, כמו גם בכל התאים באזור ההיקפי הממוקם בין הפרימורדיה (איור 4a, b ואיור משלים 8a, b). פעילות איתות GA גבוהה יותר זו נצפתה לא רק באפידרמיס אלא גם בשכבות L2 ו-L3 העליונות (איור משלים 8b). דפוס אותות ה-GA שזוהו ב-SAM באמצעות qmRGA נותר ללא שינוי לאורך זמן (איור משלים 8c-f, k). למרות שמבנה qd17mRGA ירד באופן שיטתי ב-SAM של צמחי T3 מחמישה קווים בלתי תלויים שאפיינו בפירוט, הצלחנו לנתח את דפוסי הפלואורסצנציה שהתקבלו עם מבנה pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP (איור משלים 8g-j, l). בקו בקרה זה זוהו רק שינויים קלים ביחס הפלואורסצנציה ב-SAM, אך במרכז ה-SAM ראינו ירידה ברורה ובלתי צפויה ב-VENUS הקשורה ל-TagBFP. ממצא זה מאשר שדפוס האיתות שנצפה על ידי qmRGA משקף את הפירוק התלוי ב-GA של mRGA-VENUS, אך גם מדגים ש-qmRGA עשוי להפריז בהערכת פעילות האיתות של GA במרכז המריסטמה. לסיכום, תוצאותינו חושפות דפוס איתות של GA המשקף בעיקר את התפלגות הפרימורדיה. התפלגות זו של האזור הבין-פרימורדיאלי (IPR) נובעת מהתבססות הדרגתית של פעילות איתות גבוהה של GA בין הפרימורדיה המתפתחת לאזור המרכזי, בעוד שבמקביל פעילות האיתות של GA בפרימורדיה פוחתת (איור 4c, d).
פיזור קולטני GID1b ו-GID1c (ראה לעיל) מצביע על כך שביטוי דיפרנציאלי של קולטני GA מסייע לעצב את דפוס פעילות האיתות של GA ב-SAM. תהינו האם הצטברות דיפרנציאלית של GA עשויה להיות מעורבת. כדי לחקור אפשרות זו, השתמשנו בחיישן nlsGPS1 GA FRET 21. תדירות הפעלה מוגברת זוהתה ב-SAM של nlsGPS1 שטופל ב-10 מיקרומטר GA4+7 למשך 100 דקות (איור משלים 9a-e), דבר המצביע על כך ש-nlsGPS1 מגיב לשינויים בריכוז GA ב-SAM, כפי שהוא מגיב בשורשים 21. פיזור מרחבי של תדירות ההפעלה של nlsGPS1 גילה רמות GA נמוכות יחסית בשכבות החיצוניות של ה-SAM, אך הראה שהן היו גבוהות במרכז ובגבולות ה-SAM (איור 4e ואיור משלים 9a,c). זה מצביע על כך ש-GA מופץ גם ב-SAM עם דפוס מרחבי דומה לזה שנחשף על ידי qmRGA. כגישה משלימה, טיפלנו גם ב-SAM עם GA פלואורסצנטי (GA3-, GA4-, GA7-Fl) או Fl בלבד כביקורת שלילית. אות ה-Fl הופץ ברחבי ה-SAM, כולל האזור המרכזי והפרימורדיום, אם כי בעוצמה נמוכה יותר (איור 4j ואיור משלים 10d). לעומת זאת, כל שלושת ה-GA-Fl הצטברו באופן ספציפי בתוך גבולות הפרימורדיום ובדרגות שונות בשאר ה-IPR, כאשר GA7-Fl מצטבר בתחום הגדול ביותר ב-IPR (איור 4k ואיור משלים 10a,b). כימות עוצמת הפלואורסצנציה גילה כי יחס עוצמת ה-IPR ללא IPR היה גבוה יותר ב-SAM שטופל ב-GA-Fl בהשוואה ל-SAM שטופל ב-Fl (איור 4l ואיור משלים 10c). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך ש-GA קיים בריכוזים גבוהים יותר בתאי IPR הממוקמים הקרובים ביותר לגבול האיבר. ממצא זה מצביע על כך שדפוס פעילות האיתות של GA ב-SAM נובע הן מביטוי דיפרנציאלי של קולטני GA והן מהצטברות דיפרנציאלית של GA בתאי IPR ליד גבולות האיברים. לפיכך, הניתוח שלנו גילה דפוס מרחבי-זמני בלתי צפוי של איתות GA, עם פעילות נמוכה יותר במרכז ובפרימורדיום של ה-SAM ופעילות גבוהה יותר ב-IPR באזור ההיקפי.
כדי להבין את תפקיד פעילות האיתות הדיפרנציאלית של GA ב-SAM, ניתחנו את המתאם בין פעילות האיתות של GA, התפשטות תאים וחלוקת תאים באמצעות הדמיה בזמן אמת של SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS. בהינתן תפקידו של GA בוויסות גדילה, היה צפוי מתאם חיובי עם פרמטרי התפשטות תאים. לכן, תחילה השווינו מפות פעילות איתות GA עם מפות של קצב גדילת פני התא (כמדד לחוזק התפשטות התא עבור תא נתון ועבור תאי בת בחלוקה) ועם מפות של אניזוטרופיה של גדילה, המודדת את כיווניות התפשטות התא (משמשת גם כאן עבור תא נתון ועבור תאי בת בחלוקה; איור 5a,b, ראה שיטות ושיטות משלימות). המפות שלנו של קצב גדילת פני התא של SAM עולות בקנה אחד עם תצפיות קודמות38,39, עם שיעורי גדילה מינימליים בגבול ושיעורי גדילה מקסימליים בפרחים מתפתחים (איור 5a). ניתוח רכיבים עיקריים (PCA) הראה כי פעילות איתות GA הייתה בקורלציה שלילית עם עוצמת גדילת פני התא (איור 5c). כמו כן, הראינו כי צירי השונות העיקריים, כולל קלט איתות GA ועוצמת הגדילה, היו אורתוגונליים לכיוון שנקבע על ידי ביטוי גבוה של CLV3, מה שמאשר את הדרת תאים ממרכז SAM בניתוחים הנותרים. ניתוח המתאם של ספירמן אישר את תוצאות ה-PCA (איור 5ד), דבר המצביע על כך שאותות GA גבוהים יותר ב-IPR לא הביאו להתפשטות תאים גבוהה יותר. עם זאת, ניתוח המתאם גילה מתאם חיובי קל בין פעילות איתות GA לבין אניזוטרופיה של גדילה (איור 5ג, ד), דבר המצביע על כך שאיתות GA גבוה יותר ב-IPR משפיע על כיוון צמיחת התאים ואולי על מיקום מישור חלוקת התא.
א, ב מפות חום של ממוצע צמיחת פני השטח (א) ואניסוטרופיית צמיחת פני השטח (ב) ב-SAM בממוצע על פני שבעה צמחים בלתי תלויים (משמשים כפרוקסים לחוזק ולכיוון התפשטות התאים, בהתאמה). ג ניתוח PCA כלל את המשתנים הבאים: אות GA, עוצמת צמיחת פני השטח, אניסוטרופיה של צמיחת פני השטח וביטוי CLV3. רכיב PCA 1 היה בקורלציה שלילית בעיקר עם עוצמת צמיחת פני השטח וקורלציה חיובית עם אות GA. רכיב PCA 2 היה בקורלציה חיובית בעיקר עם אניסוטרופיה של צמיחת פני השטח וקורלציה שלילית עם ביטוי CLV3. האחוזים מייצגים את השונות המוסברת על ידי כל רכיב. ד ניתוח מתאם ספירמן בין אות GA, עוצמת צמיחת פני השטח ואניסוטרופיית צמיחת פני השטח בקנה מידה של רקמה לא כולל CZ. המספר מימין הוא ערך ספירמן rho בין שני משתנים. כוכביות מציינות מקרים בהם המתאם/מתאם השלילי משמעותי ביותר. ה הדמיה תלת-ממדית של תאי Col-0 SAM L1 על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית. דפנות תא חדשות שנוצרו ב-SAM (אך לא בפרימורדיום) לאחר 10 שעות צבועות בהתאם לערכי הזווית שלהן. סרגל הצבעים מוצג בפינה הימנית התחתונה. התמונה המוקטנת מציגה את התמונה התלת-ממדית המתאימה ב-0 שעות. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. f תרשימי תיבות מציגים קצבי חלוקת תאים בצמחי SAM מסוג IPR ובצמחים שאינם מסוג IPR Col-0 (n = 10 צמחים בלתי תלויים). קו האמצע מציג את החציון, וגבולות התיבה מציינים את האחוזונים ה-25 וה-75. שרשראות מציינות את הערכים המינימליים והמקסימליים שנקבעו באמצעות תוכנת R. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן t דו-צדדי של וולץ'. g, h תרשים סכמטי המציג (g) כיצד למדוד את זווית דופן התא החדשה (מג'נטה) ביחס לכיוון הרדיאלי ממרכז ה-SAM (קו מקווקו לבן) (רק ערכי זווית חדה, כלומר 0-90°, נלקחים בחשבון), ו-(h) הכיוונים ההיקפיים/הצדדיים והרדיאליים בתוך המריסטמה. i היסטוגרמות תדר של כיוון מישור חלוקת התא על פני ה-SAM (כחול כהה), IPR (כחול בינוני) ולא-IPR (כחול בהיר), בהתאמה. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-צדדי. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. j היסטוגרמות תדר של כיוון מישור חלוקת התא של ה-IPR סביב P3 (ירוק בהיר), P4 (ירוק בינוני) ו-P5 (ירוק כהה), בהתאמה. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-צדדי. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות.
לכן, חקרנו לאחר מכן את המתאם בין איתות GA לפעילות חלוקת תאים על ידי זיהוי דפנות תאים שזה עתה נוצרו במהלך הבדיקה (איור 5e). גישה זו אפשרה לנו למדוד את התדירות והכיוון של חלוקת התאים. באופן מפתיע, מצאנו שתדירות חלוקות התאים ב-IPR ובשאר ה-SAM (non-IPR, איור 5f) הייתה דומה, דבר המצביע על כך שהבדלים באיתות GA בין תאי IPR לתאי שאינם IPR אינם משפיעים באופן משמעותי על חלוקת התא. ממצא זה, והמתאם החיובי בין איתות GA לאניזוטרופיה של הגדילה, הניעו אותנו לשקול האם פעילות איתות GA יכולה להשפיע על כיוון מישור חלוקת התא. מדדנו את כיוון דופן התא החדשה כזווית חדה יחסית לציר הרדיאלי המחבר את מרכז המריסטמה למרכז דופן התא החדשה (איור 5e-i) וצפינו בנטייה ברורה של תאים להתחלק בזוויות הקרובות ל-90° יחסית לציר הרדיאלי, כאשר התדרים הגבוהים ביותר נצפו ב-70-80° (23.28%) ו-80-90° (22.62%) (איור 5e,i), התואמים לחלוקות תאים בכיוון היקפי/רוחבי (איור 5h). כדי לבחון את תרומת איתות GA להתנהגות חלוקת תאים זו, ניתחנו פרמטרי חלוקת תאים ב-IPR ובלא-IPR בנפרד (איור 5i). צפינו כי התפלגות זווית החלוקה בתאי IPR שונה מזו שבתאי IPR או בתאים בכל ה-SAM, כאשר תאי IPR הציגו שיעור גבוה יותר של חלוקות תאים רוחביות/מעגליות, כלומר 70-80° ו-80-90° (33.86% ו-30.71%, בהתאמה, פרופורציות מקבילות) (איור 5i). לפיכך, התצפיות שלנו חשפו קשר בין איתות GA גבוה לבין כיוון מישור חלוקת תאים קרוב לכיוון ההיקפי, בדומה לקורלציה בין פעילות איתות GA לאניזוטרופיה של גדילה (איור 5c, d). כדי לבסס עוד יותר את שימור המרחב של קשר זה, מדדנו את כיוון מישור החלוקה בתאי IPR המקיפים את הפרימורדיום החל מ-P3, מכיוון שפעילות איתות GA הגבוהה ביותר זוהתה באזור זה החל מ-P4 (איור 4). זוויות החלוקה של IPR סביב P3 ו-P4 לא הראו הבדלים מובהקים סטטיסטית, אם כי נצפתה תדירות מוגברת של חלוקות תאים רוחביות ב-IPR סביב P4 (איור 5j). עם זאת, בתאי IPR סביב P5, ההבדל בכיוון מישור חלוקת התאים הפך למשמעותי סטטיסטית, עם עלייה חדה בתדירות חלוקות התאים הרוחביות (איור 5j). יחד, תוצאות אלו מצביעות על כך שאיתות GA יכול לשלוט בכיוון חלוקות התאים ב-SAM, דבר התואם דיווחים קודמים לפיהם איתות GA גבוה יכול לגרום לכיוון רוחבי של חלוקות תאים ב-IPR.
ההערכה היא שתאים ב-IPR לא ישולבו בפרימורדיה אלא באינטרינדואידים2,42,43. האוריינטציה הרוחבית של חלוקות תאים ב-IPR עשויה לגרום לארגון טיפוסי של שורות אורכיות מקבילות של תאי אפידרמיס באינטרינדואידים. התצפיות שלנו שתוארו לעיל מצביעות על כך שאיתות GA כנראה ממלא תפקיד בתהליך זה על ידי ויסות כיוון חלוקת התא.
אובדן תפקוד של מספר גנים של DELLA גורם לתגובת GA קונסטיטוטיבית, וניתן להשתמש במוטציות della כדי לבחון השערה זו44. תחילה ניתחנו את דפוסי הביטוי של חמישה גנים של DELLA ב-SAM. איחוי תעתוק של קו GUS45 גילה כי GAI, RGA, RGL1 ו-RGL2 (במידה פחותה בהרבה) באו לידי ביטוי ב-SAM (איור משלים 11a-d). הכלאה in situ הראתה עוד ש-mRNA של GAI מצטבר באופן ספציפי בפרחים פרימורדיים ובפרחים מתפתחים (איור משלים 11e). mRNA של RGL1 ו-RGL3 זוהה לאורך כל חופת ה-SAM ובפרחים ישנים יותר, בעוד ש-mRNA של RGL2 היה שופע יותר באזור הגבול (איור משלים 11f-h). הדמיה קונפוקלית של SAM pRGL3::RGL3-GFP אישרה את הביטוי שנצפה על ידי הכלאה in situ והראתה שחלבון RGL3 מצטבר בחלק המרכזי של ה-SAM (איור משלים 11i). באמצעות קו pRGA::GFP-RGA, מצאנו גם שחלבון RGA מצטבר ב-SAM, אך שפעו יורד בגבול החל מ-P4 (איור משלים 11j). ראוי לציין כי דפוסי הביטוי של RGL3 ו-RGA עולים בקנה אחד עם פעילות איתות GA גבוהה יותר ב-IPR, כפי שזוהה על ידי qmRGA (איור 4). יתר על כן, נתונים אלה מצביעים על כך שכל חלבוני ה-DELLA באים לידי ביטוי ב-SAM ושהביטוי שלהם משתרע יחד על פני כל ה-SAM.
לאחר מכן ניתחנו את פרמטרי חלוקת התאים ב-SAM מהסוג הבר (Ler, ביקורת) ובמוטנטים gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (גלובליים) (איור 6a, b). מעניין לציין, כי צפינו בשינוי מובהק סטטיסטית בהתפלגות תדירות זוויות חלוקת התאים ב-SAM המוטנטי della global בהשוואה לסוג הבר (איור 6c). שינוי זה במוטנטי della global נבע מעלייה בתדירות זוויות של 80-90° (34.71% לעומת 24.55%), ובמידה פחותה, זוויות של 70-80° (23.78% לעומת 20.18%), כלומר, תואם לחלוקות תאים רוחביות (איור 6c). תדירות החלוקות הלא-רוחביות (0-60°) הייתה נמוכה יותר גם במוטנטי della global (איור 6c). תדירות חלוקות התאים הרוחביות עלתה משמעותית ב-SAM של המוטנטי della global (איור 6b). תדירות חלוקות התאים הרוחביות ב-IPR הייתה גבוהה יותר גם במוטנט של della global בהשוואה לסוג הבר (איור 6d). מחוץ לאזור ה-IPR, לסוג הבר הייתה התפלגות אחידה יותר של זוויות חלוקת תאים, בעוד שמוטנט של della global העדיף חלוקות משיקיות כמו ה-IPR (איור 6e). כמו כן, כימתנו את כיוון חלוקות התאים ב-SAM של מוטציות חמישיות של ga2 oxidase (ga2ox) (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, ו-ga2ox6-2), רקע מוטנטי לא פעיל של GA שבו GA מצטבר. בהתאם לעלייה ברמות ה-GA, ה-SAM של התפרחת המוטנטית ga2ox המחמישית היה גדול יותר מזה של Col-0 (איור משלים 12a, b), ובהשוואה ל-Col-0, ה-SAM המוטנטי ga2ox המחמישי הראה התפלגות שונה באופן מובהק של זוויות חלוקת תאים, כאשר תדירות הזווית עולה מ-50° ל-90°, כלומר שוב מעדיף חלוקות משיקיות (איור משלים 12a-c). לפיכך, אנו מראים שהפעלה קונסטיטוטיבית של איתות GA והצטברות GA גורמות לחלוקות תאים רוחביות ב-IPR ובשאר ה-SAM.
א, ב הדמיה תלת-ממדית של שכבת L1 של Ler מוכתם ב-PI (א) ו-Global della מוטנט (ב) באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. דפנות תא חדשות שנוצרו ב-SAM (אך לא בפרימורדיום) במשך 10 שעות מוצגות וצבועות בהתאם לערכי הזווית שלהן. התמונה המוקטנת מציגה את ה-SAM ב-0 שעות. סרגל הצבעים מוצג בפינה הימנית התחתונה. החץ ב-(ב) מצביע על דוגמה של קבצי תאים מיושרים במוטנט ה-Global della. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. ce השוואה של התפלגות התדירות של אוריינטציות מישור חלוקת התאים ב-SAM השלם (ד), IPR (ה) ו-IPR לא (ו) בין Ler ל-Global della. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן Kolmogorov-Smirnov דו-צדדי. ו, ז הדמיה תלת-ממדית של תמונות קונפוקליות של SAM מוכתם ב-PI של צמחים טרנסגניים Col-0 (i) ו-pCUC2::gai-1-VENUS (י). פאנלים (a, b) מראים דפנות תא חדשות (אך לא פרימורדיה) שנוצרו ב-SAM תוך 10 שעות. הניסוי חזר על עצמו פעמיים עם תוצאות דומות. h–j השוואה של התפלגות התדירות של אוריינטציות מישור חלוקת התאים הממוקמות בכל ה-SAM (h), IPR (i) ו-non-IPR (j) בין צמחי Col-0 ו-pCUC2::gai-1-VENUS. ערכי P התקבלו באמצעות מבחן קולמוגורוב-סמירנוב דו-צדדי.
לאחר מכן בדקנו את ההשפעה של עיכוב איתות GA באופן ספציפי ב-IPR. לשם כך, השתמשנו בפרומוטר של cotyledon cup 2 (CUC2) כדי להניע את הביטוי של חלבון gai-1 שלילי דומיננטי המחובר ל-VENUS (בקו pCUC2::gai-1-VENUS). ב-SAM מהסוג הבר, הפרומוטר של CUC2 מניע את הביטוי של רוב ה-IPRs ב-SAM, כולל תאי גבול, מ-P4 ואילך, וביטוי ספציפי דומה נצפה בצמחי pCUC2::gai-1-VENUS (ראה להלן). התפלגות זוויות חלוקת התאים על פני ה-SAM או ה-IPR של צמחי pCUC2::gai-1-VENUS לא הייתה שונה באופן משמעותי מזו של הסוג הבר, אם כי באופן בלתי צפוי מצאנו שתאים ללא IPR בצמחים אלה התחלקו בתדירות גבוהה יותר של 80-90° (איור 6f-j).
הוצע כי כיוון חלוקת התא תלוי בגיאומטריה של ה-SAM, ובפרט במאמץ המתיחה שנוצר על ידי עקמומיות הרקמה 46. לכן שאלנו האם צורת ה-SAM השתנתה בצמחים della global mutant ו-pCUC2::gai-1-VENUS. כפי שדווח בעבר 12, גודל ה-SAM המוטנטי della global היה גדול יותר מזה של הסוג הפראי (איור משלים 13a, b, d). הכלאה in situ של CLV3 ו-STM RNA אישרה את התרחבות המריסטם במוטנטי della והראתה בנוסף את ההתרחבות הצידית של גומחת תאי הגזע (איור משלים 13e, f, h, i). עם זאת, עקמומיות ה-SAM הייתה דומה בשני הגנוטיפים (איור משלים 13k, m, n, p). צפינו בעלייה דומה בגודל במוטנטי gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della מרובע ללא שינוי בעקמומיות בהשוואה לסוג הפראי (איור משלים 13c, d, g, j, l, o, p). תדירות כיוון חלוקת התאים הושפעה גם במוטנט המרובע של דלה, אך במידה פחותה מאשר במוטנט המונוליתי של דלה (איור משלים 12ד-ו). אפקט מינון זה, יחד עם היעדר השפעה על העקמומיות, מצביע על כך שפעילות RGL3 שיורית במוטנט המרובע של דלה מגבילה שינויים בכיוון חלוקת התא הנגרמים עקב אובדן פעילות DELLA וכי שינויים בחלוקות תאים רוחביות מתרחשים בתגובה לשינויים בפעילות איתות GA ולא לשינויים בגיאומטריית SAM. כפי שתואר לעיל, פרומוטר CUC2 מניע את ביטוי IPR ב-SAM החל מ-P4 (איור משלים 14א', ב'), ובניגוד לכך, ל-pCUC2::gai-1-VENUS SAM היה גודל מצומצם יותר אך עקמומיות גבוהה יותר (איור משלים 14ג-ח'). שינוי זה במורפולוגיה של pCUC2::gai-1-VENUS SAM עשוי לגרום להתפלגות שונה של מאמצים מכניים בהשוואה לסוג הבר, שבו מאמצים היקפיים גבוהים מתחילים במרחק קצר יותר ממרכז ה-SAM . לחלופין, השינויים במורפולוגיה של pCUC2::gai-1-VENUS SAM עשויים לנבוע משינויים בתכונות מכניות אזוריות הנגרמות על ידי ביטוי טרנסגן48. בשני המקרים, הדבר יכול לקזז חלקית את השפעות השינויים באיתות GA על ידי הגדלת הסבירות שהתאים יתחלקו בכיוון היקפי/רוחבי, מה שמסביר את התצפיות שלנו.
בסך הכל, הנתונים שלנו מאשרים כי איתות GA גבוה יותר ממלא תפקיד פעיל באוריינטציה הצידית של מישור חלוקת התא ב-IPR. הם גם מראים כי עקמומיות המריסטם משפיעה גם על האוריינטציה של מישור חלוקת התא ב-IPR.
האוריינטציה הרוחבית של מישור החלוקה ב-IPR, עקב פעילות גבוהה של איתות GA, מצביעה על כך ש-GA מארגן מראש קובץ תאים רדיאלי באפידרמיס בתוך ה-SAM כדי להגדיר את הארגון התאי שיימצא מאוחר יותר בתוך הפנימי של האפידרמיס. ואכן, קבצי תאים כאלה נראו לעתים קרובות בתמונות SAM של מוטציות della global (איור 6b). לכן, כדי לחקור לעומק את הפונקציה ההתפתחותית של התבנית המרחבית של איתות GA ב-SAM, השתמשנו בהדמיית זמן-התאוששות כדי לנתח את הארגון המרחבי של תאים ב-IPR בצמחים טרנסגניים מסוג wild-type (Ler ו-Col-0), della global מוטציות, ו-pCUC2::gai-1-VENUS.
מצאנו ש-qmRGA הראה שפעילות איתות GA ב-IPR גדלה מ-P1/P2 והגיעה לשיאה ב-P4, ודפוס זה נותר קבוע לאורך זמן (איור 4a-f ואיור משלים 8c-f, k). כדי לנתח את הארגון המרחבי של תאים ב-IPR עם אות GA הולך וגובר, סימנו את תאי Ler IPR מעל ולצדדי P4 בהתאם לגורל ההתפתחותי שלהם שנותחו 34 שעות לאחר התצפית הראשונה, כלומר, יותר משתי זמני פלסטידים, מה שאפשר לנו לעקוב אחר תאי IPR במהלך התפתחות הפרימורדיום מ-P1/P2 ל-P4. השתמשנו בשלושה צבעים שונים: צהוב עבור אותם תאים שהשתלבו בפרימורדיום ליד P4, ירוק עבור אלה שהיו ב-IPR, וסגול עבור אלה שהשתתפו בשני התהליכים (איור 7a-c). ב-t0 (0 שעות), 1-2 שכבות של תאי IPR היו גלויות מול P4 (איור 7a). כצפוי, כאשר תאים אלה התחלקו, הם עשו זאת בעיקר דרך מישור החלוקה הרוחבי (איורים 7a-c). תוצאות דומות התקבלו באמצעות Col-0 SAM (תוך התמקדות ב-P3, שגבולו מתקפל בדומה ל-P4 ב-Ler), אם כי בגנוטיפ זה הקפל שנוצר בגבול הפרחוני הסתיר את תאי IPR מהר יותר (איור 7g-i). לפיכך, דפוס החלוקה של תאי IPR מארגן מראש את התאים לשורות רדיאליות, כמו באיברים הפנימיים. ארגון השורות הרדיאליות ומיקומם של תאי IPR בין איברים עוקבים מצביעים על כך שתאים אלה הם אבות פנימיים.
כאן, פיתחנו ביוסנסור רציומטרי לאיתות GA, qmRGA, המאפשר מיפוי כמותי של פעילות איתות GA הנובעת משילוב של GA וקולטני GA תוך מזעור הפרעה למסלולי איתות אנדוגניים, ובכך מספק מידע על תפקוד GA ברמה התאית. לשם כך, בנינו חלבון DELLA שעבר שינוי, mRGA, שאיבד את היכולת להיקשר לשותפי אינטראקציה של DELLA אך נותר רגיש לפרוטאוליזה המושרה על ידי GA. qmRGA מגיב לשינויים אקסוגניים ואנדוגניים כאחד ברמות GA, ותכונות החישה הדינמיות שלו מאפשרות הערכה של שינויים מרחביים-זמניים בפעילות איתות GA במהלך ההתפתחות. qmRGA הוא גם כלי גמיש מאוד מכיוון שניתן להתאים אותו לרקמות שונות על ידי שינוי הפרומוטר המשמש לביטוי שלו (במידת הצורך), ובהינתן האופי השמור של מסלול האיתות של GA ומוטיב PFYRE על פני אנגיוספרמים, סביר להניח שהוא ניתן להעברה למינים אחרים. בהתאם לכך, מוטציה מקבילה בחלבון האורז SLR1 DELLA (HYY497AAA) הוכחה גם היא כמדכאת את פעילות מדכא הגדילה של SLR1 תוך הפחתה קלה בלבד של הפירוק שלו בתיווך GA, בדומה ל-mRGA23. ראוי לציין כי מחקרים אחרונים בארבידופסיס הראו כי מוטציה של חומצת אמינו בודדת בתחום PFYRE (S474L) שינתה את פעילות התעתוק של RGA מבלי להשפיע על יכולתו לתקשר עם שותפים לגורמי שעתוק50. למרות שמוטציה זו קרובה מאוד לשלושת החלפות חומצות האמינו הקיימות ב-mRGA, המחקרים שלנו מראים ששתי מוטציות אלו משנות מאפיינים שונים של DELLA. למרות שרוב שותפי גורמי השעתוק נקשרים לתחומי LHR1 ו-SAW של DELLA26,51, חלק מחומצות האמינו השמורות בתחום PFYRE עשויות לסייע בייצוב אינטראקציות אלו.
התפתחות פנימיות היא מאפיין מפתח בארכיטקטורת צמחים ובשיפור היבול. qmRGA גילה פעילות איתות GA גבוהה יותר בתאי אב פנימיות IPR. על ידי שילוב של הדמיה כמותית וגנטיקה, הראינו שדפוסי איתות GA מניחים מישורי חלוקת תאים מעגליים/רוחביים באפידרמיס SAM, ומעצבים את ארגון חלוקת התאים הנדרש להתפתחות פנימיות. מספר מווסתים של כיוון מישור חלוקת התא זוהו במהלך הפיתוח 52,53. עבודתנו מספקת דוגמה ברורה לאופן שבו פעילות איתות GA מווסתת פרמטר תאי זה. DELLA יכול לתקשר עם קומפלקסים של חלבונים טרום-קיפול 41, כך שאיתות GA עשוי לווסת את כיוון מישור חלוקת התא על ידי השפעה ישירה על כיוון המיקרוטובולים הקורטיקליים 40,41,54,55. באופן בלתי צפוי הראינו שב-SAM, המתאם לפעילות איתות GA גבוהה יותר לא היה התארכות או חלוקת תאים, אלא רק אניזוטרופיה של גדילה, דבר התואם השפעה ישירה של GA על כיוון חלוקת התא ב-IPR. עם זאת, איננו יכולים לשלול שהשפעה זו יכולה להיות גם עקיפה, למשל בתיווך ריכוך דופן תא המושרה על ידי GA 56. שינויים בתכונות דופן התא גורמים ללחץ מכני57,58, אשר יכול גם להשפיע על כיוון מישור חלוקת התא על ידי השפעה על כיוון המיקרוטובולים הקורטיקליים39,46,59. ההשפעות המשולבות של לחץ מכני המושרה על ידי GA וויסות ישיר של כיוון המיקרוטובולים על ידי GA עשויות להיות מעורבות ביצירת דפוס ספציפי של כיוון חלוקת תאים ב-IPR כדי להגדיר פנימיות, ויש צורך במחקרים נוספים כדי לבחון רעיון זה. באופן דומה, מחקרים קודמים הדגישו את החשיבות של חלבוני TCP14 ו-15 המקיימים אינטראקציה עם DELLA בבקרה על היווצרות פנימיות60,61 וגורמים אלה עשויים לתווך את פעולת GA יחד עם BREVIPEDICELLUS (BP) ו-PENNYWISE (PNY), אשר מווסתים את התפתחות הפנימיות והוכחו כמשפיעים על איתות GA2,62. בהינתן ש-DELLAs מקיימים אינטראקציה עם מסלולי איתות של ברסינוסטרואידים, אתילן, חומצה יסמונית וחומצה אבציסית (ABA)63,64 ושהורמונים אלה יכולים להשפיע על כיוון המיקרוטובולים65, השפעות GA על כיוון חלוקת התא עשויות להיות מתווכות גם על ידי הורמונים אחרים.
מחקרים ציטולוגיים מוקדמים הראו כי גם האזורים הפנימיים וגם האזורים החיצוניים של תא ה-SAM של ארבידופסיס נדרשים להתפתחות פנימיות 2,42. העובדה ש-GA מווסת באופן פעיל את חלוקת התאים ברקמות הפנימיות 12 תומכת בפונקציה כפולה של GA בוויסות המריסטמה וגודל הפנימיות ב-SAM. דפוס חלוקת התאים הכיוונית מווסת היטב גם ברקמת ה-SAM הפנימית, וויסות זה חיוני לצמיחת הגבעול 52. יהיה מעניין לבחון האם GA ממלא גם תפקיד בכיוון מישור חלוקת התאים בארגון ה-SAM הפנימי, ובכך מסנכרן את המפרט וההתפתחות של פנימיות בתוך ה-SAM.
צמחים גודלו במבחנה באדמה או במדיום Murashige-Skoog (MS) 1x (Duchefa) בתוספת 1% סוכרוז ו-1% אגר (Sigma) בתנאים סטנדרטיים (16 שעות אור, 22 מעלות צלזיוס), למעט ניסויי גידול היפוקוטיל והשורשים שבהם גודלו השתילים על פלטות אנכיות תחת אור קבוע ו-22 מעלות צלזיוס. עבור ניסויי ניטרט, גודלו הצמחים על מדיום MS שעבר שינוי (מדיום צמחי bioWORLD) בתוספת כמות מספקת של ניטרט (0 או 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-סוקצינט, 1% סוכרוז ו-1% A-אגר (Sigma) בתנאי יום ארוך.
cDNA של GID1a שהוכנס ל-pDONR221 שולב מחדש עם pDONR P4-P1R-pUBQ10 ו-pDONR P2R-P3-mCherry לתוך pB7m34GW ליצירת pUBQ10::GID1a-mCherry. DNA של IDD2 שהוכנס ל-pDONR221 שולב מחדש לתוך pB7RWG266 ליצירת p35S:IDD2-RFP. כדי לייצר pGID1b::2xmTQ2-GID1b, פרגמנט בגודל 3.9 קילו-בייט במעלה הזרם של אזור הקידוד של GID1b ופרגמנט בגודל 4.7 קילו-בייט המכיל את cDNA GID1b (1.3 קילו-בייט) ואת הטרמינטור (3.4 קילו-בייט) הוגברו תחילה באמצעות הפריימרים בטבלה המשלימה 3 ולאחר מכן הוכנסו ל-pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) ול-pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), בהתאמה, ולבסוף שולבו מחדש עם pDONR221 2xmTQ268 לתוך וקטור המטרה pGreen 012567 באמצעות שיבוט Gateway. כדי לייצר pCUC2::LSSmOrange, רצף הפרומוטר של CUC2 (3229 בסיסים במעלה הזרם של ATG) ואחריו רצף הקידוד של mOrange גדול עם הזזת Stokes (LSSmOrange)69 עם אות הלוקליזציה הגרעיני N7 וטרמינטור התעתוק NOS הורכבו לתוך וקטור הכוונת קנמיצין pGreen באמצעות מערכת רקומבינציה של 3-פרגמנטים Gateway (Invitrogen). הווקטור הבינארי הצמחי הוכנס לזן Agrobacterium tumefaciens GV3101 והוחדר לעלי Nicotiana benthamiana בשיטת חדירת Agrobacterium ול-Arabidopsis thaliana Col-0 בשיטת טבילה פרחונית, בהתאמה. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry ו-pCLV3::mCherry-NLS qmRGA בודדו מצאצאי F3 ו-F1 של ההכלאות, בהתאמה.
הכלאה של RNA in situ בוצעה על קצות נצרים באורך של כ-1 ס"מ72, אשר נאספו וקובעו מיד בתמיסת FAA (3.7% פורמלדהיד, 5% חומצה אצטית, 50% אתנול) שקוררה מראש ל-4 מעלות צלזיוס. לאחר 2 טיפולי ואקום של 15 דקות, הקיבוע הוחלף והדגימות הודגרו למשך הלילה. cDNA של GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 ו-RGL3 וגששי antisense ל-3'-UTRs שלהם סונתזו באמצעות הפריימרים המוצגים בטבלה המשלימה 3 כמתואר על ידי רוזייר ואחרים73. גלאים המסומנים בדיגוקסיגנין אותרו באופן אימונו-זיהוי באמצעות נוגדנים נגד דיגוקסיגנין (דילול פי 3000; Roche, מספר קטלוגי: 11 093 274 910), וחתכים נצבעו בתמיסה 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל פוספט (BCIP, דילול פי 250)/ניטרובלו טטרזוליום (NBT, דילול פי 200).