תמותה ורעילות של תכשירים מסחריים של ציפרמטרין לראשנים קטנים במים

מחקר זה העריך את הקטלניות, התת-הקטלניות והרעילות של תרופות מסחריותציפרמטריןניסוחים לראשנים אנוראניים. במבחן האקוטי, נבדקו ריכוזים של 100-800 מיקרוגרם/ליטר במשך 96 שעות. במבחן הכרוני, נבדקו ריכוזי ציפרמתרין טבעיים (1, 3, 6 ו-20 מיקרוגרם/ליטר) לתמותה, ולאחר מכן בוצעו בדיקות מיקרו-גרעין ואנומליות גרעיניות בתאי דם אדומים במשך 7 ימים. LC50 של ניסוח הציפרמתרין המסחרי לראשנים היה 273.41 מיקרוגרם ליטר. במבחן הכרוני, הריכוז הגבוה ביותר (20 מיקרוגרם ליטר) הביא לתמותה של יותר מ-50%, מכיוון שהוא הרג מחצית מהראשנים שנבדקו. מבחן המיקרו-גרעין הראה תוצאות משמעותיות ב-6 ו-20 מיקרוגרם ליטר ומספר אנומליות גרעיניות זוהו, דבר המצביע על כך שלניסוח הציפרמתרין המסחרי יש פוטנציאל גנוטוקסי כנגד P. gracilis. ציפרמתרין מהווה סיכון גבוה עבור מין זה, דבר המצביע על כך שהוא יכול לגרום לבעיות מרובות ולהשפיע על הדינמיקה של מערכת אקולוגית זו בטווח הקצר והארוך. לכן, ניתן להסיק כי לתכשירים מסחריים של ציפרמתרין יש השפעות רעילות על P. gracilis.
עקב ההתרחבות המתמשכת של הפעילות החקלאית והיישום האינטנסיבי שלהדברהבמסגרת אמצעים אלה, בעלי חיים ימיים נחשפים לעתים קרובות לחומרי הדברה1,2. זיהום משאבי מים ליד שדות חקלאיים יכול להשפיע על התפתחותם והישרדותם של אורגניזמים שאינם מטרה, כגון דו-חיים.
דו-חיים הופכים לחשובים יותר ויותר בהערכת מטריצות סביבתיות. אנוראנים נחשבים לאינדיקטורים ביולוגיים טובים למזהמים סביבתיים בשל מאפייניהם הייחודיים כגון מחזורי חיים מורכבים, קצב גדילה מהיר של הזחלים, מצב טרופי, עור חדיר10,11, תלות במים לרבייה12 וביצים לא מוגנות11,13,14. צפרדע המים הקטנה (Physalaemus gracilis), הידועה בכינויה הצפרדע הבוכייה, הוכחה כמין אינדיקטורים ביולוגיים לזיהום חומרי הדברה4,5,6,7,15. המין נמצא במים עומדים, אזורים מוגנים או אזורים עם בתי גידול משתנים בארגנטינה, אורוגוואי, פרגוואי וברזיל1617 ונחשב יציב על ידי סיווג ה-IUCN בשל תפוצתו הרחבה וסבילותו לבתי גידול שונים18.
דווח על השפעות תת-קטלניות בדו-חיים לאחר חשיפה לציפרמתרין, כולל שינויים התנהגותיים, מורפולוגיים וביוכימיים בראשנים23,24,25, שינויים בזמן התמותה ובזמן המטמורפוזה, שינויים אנזימטיים, ירידה בהצלחת הבקיעה24,25, היפראקטיביות26, עיכוב פעילות כולין אסטראז27 ושינויים בביצועי השחייה7,28. עם זאת, מחקרים על ההשפעות הגנוטוקסיות של ציפרמתרין בדו-חיים מוגבלים. לכן, חשוב להעריך את הרגישות של מינים אנוראניים לציפרמתרין.
זיהום סביבתי משפיע על הגדילה וההתפתחות התקינות של דו-חיים, אך ההשפעה השלילית החמורה ביותר היא נזק גנטי ל-DNA הנגרם מחשיפה לחומרי הדברה13. ניתוח מורפולוגיה של תאי דם הוא אינדיקטור ביולוגי חשוב לזיהום ולרעילות פוטנציאלית של חומר למינים פראיים29. בדיקת המיקרו-גרעינים היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לקביעת הגנוטוקסיות של כימיקלים בסביבה30. זוהי שיטה מהירה, יעילה וזולה המהווה אינדיקטור טוב לזיהום כימי של אורגניזמים כמו דו-חיים31,32 ויכולה לספק מידע על חשיפה למזהמים גנוטוקסיים33.
מטרת מחקר זה הייתה להעריך את הפוטנציאל הרעיל של פורמולות ציפרמתרין מסחריות לראשנים מימיים קטנים באמצעות בדיקת מיקרונוקלאוס והערכת סיכונים אקולוגיים.
תמותה מצטברת (%) של ראשנים מסוג P. gracilis שנחשפו לריכוזים שונים של ציפרמתרין מסחרי במהלך התקופה האקוטית של הבדיקה.
תמותה מצטברת (%) של ראשנים מסוג P. gracilis שנחשפו לריכוזים שונים של ציפרמתרין מסחרי במהלך בדיקה כרונית.
התמותה הגבוהה שנצפתה נבעה מהשפעות גנוטוקסיות בדו-חיים שנחשפו לריכוזים שונים של ציפרמתרין (6 ו-20 מיקרוגרם/ליטר), כפי שמעידה נוכחות מיקרו-גרעינים (MN) ואנומליות גרעיניות בכדוריות הדם האדומות. היווצרות MN מצביעה על שגיאות במיטוזה וקשורה לקשירה לקויה של כרומוזומים למיקרוטובולים, פגמים במתחמי חלבונים האחראים על קליטה והובלה של כרומוזומים, שגיאות בהפרדת כרומוזומים ושגיאות בתיקון נזקי DNA38,39 וייתכן שהיא קשורה לעקה חמצונית הנגרמת על ידי חומרי הדברה40,41. אנומליות אחרות נצפו בכל הריכוזים שנבדקו. עלייה בריכוזי הציפרמתרין הגבירה את האנומליות הגרעיניות בכדוריות הדם האדומות ב-5% ו-20% במינונים הנמוכים ביותר (1 מיקרוגרם/ליטר) והגבוהים ביותר (20 מיקרוגרם/ליטר), בהתאמה. לדוגמה, שינויים ב-DNA של מין עלולים להיות בעלי השלכות חמורות על הישרדות בטווח הקצר והארוך, וכתוצאה מכך ירידה באוכלוסייה, שינוי בכושר הרבייה, נישואים קרובים, אובדן גיוון גנטי ושינוי בשיעורי הנדידה. כל הגורמים הללו יכולים להשפיע על הישרדות ותחזוקת המינים42,43. היווצרות של אנומליות אריתרואידיות עשויה להצביע על חסימה בציטוקינזה, וכתוצאה מכך חלוקת תאים לא תקינה (אריתרוציטים דו-גרעיניים)44,45; גרעינים מרובי-אונות הם בליטות של קרום הגרעין עם אונות מרובות46, בעוד שאנומליות אריתרואידיות אחרות עשויות להיות קשורות להגברת DNA, כגון כליות/בועות גרעיניות47. נוכחות של אריתרוציטים חסרי גרעין עשויה להצביע על פגיעה בהעברת חמצן, במיוחד במים מזוהמים48,49. אפופטוזיס מצביע על מוות תאי50.
מחקרים אחרים הדגימו גם את ההשפעות הגנוטוקסיות של ציפרמתרין. קבנה ועמיתיו51 הדגימו את נוכחותם של מיקרו-גרעינים ושינויים גרעיניים כגון תאים דו-גרעיניים ותאים אפופטוטיים בתאי Odontophrynus americanus לאחר חשיפה לריכוזים גבוהים של ציפרמתרין (5000 ו-10,000 מיקרוגרם ליטר) למשך 96 שעות. אפופטוזיס המושרה על ידי ציפרמתרין זוהה גם ב-P. biligonigerus52 וב-Rhinella arenarum53. תוצאות אלו מצביעות על כך שלציפרמתרין יש השפעות גנוטוקסיות על מגוון אורגניזמים ימיים וכי בדיקת MN ו-ENA עשויה להיות אינדיקטור להשפעות תת-קטלניות על דו-חיים ועשויה להיות רלוונטית למינים מקומיים ולאוכלוסיות בר שנחשפו לרעלנים12.
פורמולציות מסחריות של ציפרמתרין מהוות סיכון סביבתי גבוה (אקוטי וכרוני כאחד), כאשר ערכי ה-NOEC חורגים מרמת הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (EPA)54, דבר שעלול להשפיע לרעה על המין אם הוא נוכח בסביבה. בהערכת הסיכון הכרוני, ה-NOEC לתמותה היה 3 מיקרוגרם ליטר, מה שמאשר שהריכוזים שנמצאו במים עלולים להוות סיכון למין55. ה-NOEC הקטלני עבור זחלי R. arenarum שנחשפו לתערובת של אנדוסולפן וציפרמתרין היה 500 מיקרוגרם ליטר לאחר 168 שעות; ערך זה ירד ל-0.0005 מיקרוגרם ליטר לאחר 336 שעות. המחברים מראים שככל שהחשיפה ארוכה יותר, כך הריכוזים המזיקים למין נמוכים יותר. חשוב גם להדגיש שערכי ה-NOEC היו גבוהים יותר מאלה של P. gracilis באותו זמן חשיפה, דבר המצביע על כך שתגובת המין לציפרמתרין היא ספציפית למין. יתר על כן, מבחינת תמותה, ערך ה-CHQ של P. gracilis לאחר חשיפה לציפרמתרין הגיע ל-64.67, שהוא גבוה מערך הייחוס שקבעה הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב54, וגם ערך ה-CHQ של זחלי R. arenarum היה גבוה מערך זה (CHQ > 388.00 לאחר 336 שעות), דבר המצביע על כך שקוטלי החרקים שנחקרו מהווים סיכון גבוה למספר מיני דו-חיים. בהתחשב בכך ש-P. gracilis דורש כ-30 יום כדי להשלים מטמורפוזה56, ניתן להסיק כי ריכוזי הציפרמתרין שנחקרו עשויים לתרום לירידה באוכלוסייה על ידי מניעת כניסה של פרטים נגועים לשלב הבוגר או הרבייה בגיל צעיר.
בהערכת הסיכון המחושבת של מיקרו-גרעינים ואנומליות אחרות בגרעין כדוריות הדם האדומות, ערכי ה-CHQ נעו בין 14.92 ל-97.00, דבר המצביע על כך שלציפרמתרין יש סיכון גנוטוקסי פוטנציאלי ל-P. gracilis אפילו בסביבתו הטבעית. בהתחשב בתמותה, הריכוז המקסימלי של תרכובות קסנוביוטיות הנסבלות ל-P. gracilis היה 4.24 מיקרוגרם לליטר. עם זאת, ריכוזים נמוכים עד כדי 1 מיקרוגרם/ליטר הראו גם הם השפעות גנוטוקסיות. עובדה זו עשויה להוביל לעלייה במספר הפרטים החריגים ולהשפיע על התפתחות ורבייה של מינים בבתי הגידול שלהם, מה שמוביל לירידה באוכלוסיות הדו-חיים.
פורמולציות מסחריות של קוטל החרקים ציפרמתרין הראו רעילות גבוהה חריפה וכרונית ל-P. gracilis. שיעורי תמותה גבוהים יותר נצפו, ככל הנראה עקב השפעות רעילות, כפי שמעידים נוכחותם של חריגות בגרעיני מיקרו-גרעינים ובגרעינים אדומים, במיוחד גרעינים משוננים, גרעינים אונות וגרעינים שלפוחיות. בנוסף, המינים הנחקרים הראו סיכונים סביבתיים מוגברים, הן חריפים והן כרוניים. נתונים אלה, בשילוב עם מחקרים קודמים של קבוצת המחקר שלנו, הראו שאפילו פורמולציות מסחריות שונות של ציפרמתרין עדיין גרמו לירידה בפעילות אצטילכולין אסטראז (AChE) ובוטירילכולין אסטראז (BChE) וללחץ חמצוני 58, והביאו לשינויים בפעילות השחייה ומומים בחלל הפה 59 ב-P. gracilis, דבר המצביע על כך שלפורמולציות מסחריות של ציפרמתרין יש רעילות קטלנית ותת-קטלנית גבוהה למין זה. הרטמן ועמיתיו 60 מצאו שנימולציות מסחריות של ציפרמתרין היו הרעילות ביותר ל-P. gracilis ולמין אחר מאותו סוג (P. cuvieri) בהשוואה לתשעה חומרי הדברה אחרים. הדבר מצביע על כך שריכוזים שאושרו כחוק של ציפרמתרין להגנה על הסביבה עלולים לגרום לתמותה גבוהה ולירידה ארוכת טווח באוכלוסייה.
יש צורך במחקרים נוספים כדי להעריך את רעילות חומר ההדברה לדו-חיים, שכן הריכוזים הנמצאים בסביבה עלולים לגרום לתמותה גבוהה ולהוות סיכון פוטנציאלי ל-P. gracilis. יש לעודד מחקר על מיני דו-חיים, שכן נתונים על אורגניזמים אלה מועטים, במיוחד על מינים ברזילאים.
מבחן הרעילות הכרונית נמשך 168 שעות (7 ימים) בתנאים סטטיים והריכוזים התת-קטלניים היו: 1, 3, 6 ו-20 מיקרוגרם ai L−1. בשני הניסויים, 10 ראשנים לכל קבוצת טיפול הוערכו בשש חזרות, בסך הכל 60 ראשנים לכל ריכוז. בינתיים, הטיפול במים בלבד שימש כביקורת שלילית. כל מערך ניסוי כלל צלחת זכוכית סטרילית בנפח של 500 מ"ל וצפיפות של ראשן אחד לכל 50 מ"ל של תמיסה. הבקבוק כוסה בניילון פוליאתילן כדי למנוע אידוי ואוורר באופן רציף.
המים נותחו כימית כדי לקבוע את ריכוזי חומרי ההדברה ב-0, 96 ו-168 שעות. על פי סבין ואחרים 68 ומרטינס ואחרים 69, הניתוחים בוצעו במעבדה לניתוח חומרי הדברה (LARP) של האוניברסיטה הפדרלית של סנטה מריה באמצעות כרומטוגרפיית גז בשילוב ספקטרומטריית מסה משולשת קוואדרופלית (מודל Varian 1200, פאלו אלטו, קליפורניה, ארה"ב). הקביעה הכמותית של חומרי הדברה במים מוצגת כחומר משלים (טבלה SM1).
עבור בדיקת המיקרו-גרעין (MNT) ובדיקת האנומליות הגרעינית של תאי דם אדומים (RNA), נותחו 15 ראשנים מכל קבוצת טיפול. הראשנים הורדו עם 5% לידוקאין (50 מ"ג g-170) ודגימות דם נאספו באמצעות ניקור לבבי באמצעות מזרקים חד פעמיים שעברו הפרין. מריחות דם הוכנו על גבי שקופיות מיקרוסקופ סטריליות, יובשו באוויר, קובעו עם 100% מתנול (4 מעלות צלזיוס) למשך 2 דקות, ולאחר מכן נצבעו בתמיסת ג'ימזה 10% למשך 15 דקות בחושך. בסוף התהליך, השקופיות נשטפו במים מזוקקים כדי להסיר עודפי צבע ויובשו בטמפרטורת החדר.
לפחות 1000 תאי דם אדומים מכל ראשן נותחו באמצעות מיקרוסקופ 100× עם עדשה 71 כדי לקבוע את נוכחותם של MN ו-ENA. סך של 75,796 תאי דם אדומים מראשנים הוערכו תוך התחשבות בריכוזי ציפרמתרין ובקבוצת הביקורת. גנוטוקסיות נותחה לפי שיטת Carrasco et al. ו-Fenech et al.38,72 על ידי קביעת שכיחות הנגעים הגרעיניים הבאים: (1) תאים אנוקליאטים: תאים ללא גרעינים; (2) תאים אפופטוטיים: פרגמנטציה גרעינית, מוות תאי מתוכנת; (3) תאים דו-גרעיניים: תאים עם שני גרעינים; (4) ניצני גרעין או תאי בועות: תאים עם גרעינים עם בליטות קטנות של קרום הגרעין, בועות בגודלן דומה למיקרו-גרעינים; (5) תאים שעברו קריוליזה: תאים עם קווי מתאר של הגרעין בלבד ללא חומר פנימי; (6) תאים מחורצים: תאים עם גרעינים עם סדקים או חריצים ברורים בצורתם, הנקראים גם גרעינים בצורת כליה; (7) תאים אונתיים: תאים עם בליטות גרעיניות גדולות יותר מהשלפוחיות שהוזכרו לעיל; ו-(8) מיקרו-תאים: תאים עם גרעינים מרוכזים וציטופלזמה מצומצמת. השינויים הושוו לתוצאות הבקרה השליליות.
תוצאות בדיקת הרעילות החריפה (LC50) נותחו באמצעות תוכנת GBasic ושיטת TSK-Trimmed Spearman-Karber74. נתוני הבדיקה הכרונית נבדקו מראש עבור נורמליות השגיאה (Shapiro-Wilks) והומוגניות השונות (Bartlett). התוצאות נותחו באמצעות ניתוח שונות חד-כיווני (ANOVA). מבחן טוקי שימש להשוואת נתונים בינם לבין עצמם, ומבחן דאנט שימש להשוואת נתונים בין קבוצת הטיפול לקבוצת הביקורת השלילית.
נתוני LOEC ו-NOEC נותחו באמצעות מבחן דנט. מבחנים סטטיסטיים בוצעו באמצעות תוכנת Statistica 8.0 (StatSoft) עם רמת מובהקות של 95% (p < 0.05).