תמותה ורעילות של תכשירי ציפרמטרין מסחריים לראשנים מימיים קטנים

מחקר זה העריך את הקטלניות, תת-התלתליות והרעילות של מסחרציפרמטריןניסוחים לראשנים אנוראנים. בבדיקה החריפה נבדקו ריכוזים של 100-800 מיקרוגרם/ליטר למשך 96 שעות. בבדיקה הכרונית, ריכוזי ציפרמטרין המופיעים באופן טבעי (1, 3, 6 ו-20 מיקרוגרם/ליטר) נבדקו לתמותה, ולאחר מכן נבדקו בדיקת מיקרו-גרעין וחריגות גרעיניות של תאי דם אדומים למשך 7 ימים. ה-LC50 של תכשיר ה-Cypermethrin המסחרי לראשנים היה 273.41 מיקרוגרם L-1. בבדיקה הכרונית, הריכוז הגבוה ביותר (20 מיקרוגרם L-1) הביא לתמותה של יותר מ-50%, שכן הוא הרג מחצית מהראשנים שנבדקו. בדיקת המיקרו-גרעין הראתה תוצאות משמעותיות ב-6 ו-20 מיקרוגרם L-1 ומספר חריגות גרעיניות זוהו, מה שמצביע על כך שלפורמולציה המסחרית של cypermethrin יש פוטנציאל גנוטוקסי נגד P. gracilis. Cypermethrin הוא סיכון גבוה למין זה, מה שמעיד על כך שהוא יכול לגרום לבעיות מרובות ולהשפיע על הדינמיקה של מערכת אקולוגית זו בטווח הקצר והארוך. לכן, ניתן להסיק שלניסוחים מסחריים של סייפרמטרין יש השפעות רעילות על P. gracilis.
עקב התרחבות מתמשכת של הפעילות החקלאית ויישום אינטנסיבי שלהדברהאמצעים, חיות מים חשופות לעתים קרובות לחומרי הדברה1,2. זיהום משאבי מים בקרבת שדות חקלאיים יכול להשפיע על התפתחות והישרדות של אורגניזמים שאינם מטרה כגון דו-חיים.
דו-חיים הופכים חשובים יותר ויותר בהערכת מטריצות סביבתיות. אנוראנים נחשבים לאינדיקטורים ביולוגיים טובים למזהמים סביבתיים בשל המאפיינים הייחודיים שלהם כגון מחזורי חיים מורכבים, קצבי גדילה מהירים של זחל, מצב טרופי, עור חדיר10,11, תלות במים לצורך רבייה12 וביצים לא מוגנות11,13,14. צפרדע המים הקטנה (Physalaemus gracilis), הידועה בכינויה הצפרדע הבוכייה, הוכחה כמין ביולוגי של זיהום חומרי הדברה4,5,6,7,15. המין נמצא במים עומדים, אזורים מוגנים או אזורים בעלי בית גידול משתנה בארגנטינה, אורוגוואי, פרגוואי וברזיל1617 ונחשב ליציב לפי סיווג IUCN בשל תפוצתו הרחבה וסובלנותו לבתי גידול שונים18.
השפעות תת-קטלניות דווחו בדו-חיים בעקבות חשיפה ל-cypermethrin, כולל שינויים התנהגותיים, מורפולוגיים וביוכימיים בראשנים23,24,25, שינויים בתמותה ובזמן המטמורפוזה, שינויים אנזימטיים, ירידה בהצלחת הבקיעה24,25, היפראקטיביות26, עיכוב בפעילות כולינאז, עיכוב בביצועים של כולינאז ו-28. עם זאת, מחקרים על ההשפעות הגנוטוקסיות של cypermethrin בדו-חיים מוגבלים. לכן, חשוב להעריך את הרגישות של מיני אנורן ל-cypermethrin.
זיהום סביבתי משפיע על גדילה והתפתחות תקינים של דו-חיים, אך ההשפעה השלילית החמורה ביותר היא נזק גנטי ל-DNA הנגרם כתוצאה מחשיפה לחומרי הדברה13. ניתוח מורפולוגיה של תאי דם הוא אינדיקטור ביולוגי חשוב לזיהום ורעילות פוטנציאלית של חומר למין בר29. בדיקת המיקרו-גרעין היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לקביעת הגנוטוקסיות של כימיקלים בסביבה30. זוהי שיטה מהירה, יעילה וזולה המהווה אינדיקטור טוב לזיהום כימי של אורגניזמים כמו דו-חיים31,32 ויכולה לספק מידע על חשיפה למזהמים גנוטוקסיים33.
מטרת מחקר זה הייתה להעריך את הפוטנציאל הרעיל של ניסוחי ציפרמטרין מסחריים לראשנים מימיים קטנים באמצעות בדיקת מיקרו-גרעין והערכת סיכונים אקולוגית.
תמותה מצטברת (%) של ראשן P. gracilis שנחשפו לריכוזים שונים של ציפרמטרין מסחרי במהלך התקופה החריפה של הבדיקה.
תמותה מצטברת (%) של ראשנים מסוג P. gracilis שנחשפו לריכוזים שונים של ציפרמתרין מסחרי במהלך בדיקה כרונית.
התמותה הגבוהה שנצפתה הייתה תוצאה של השפעות גנוטוקסיות בדו-חיים שנחשפו לריכוזים שונים של cypermethrin (6 ו-20 מיקרוגרם/ליטר), כפי שהוכח על ידי נוכחות של מיקרו-גרעינים (MN) וחריגות גרעיניות באדמית. היווצרות MN מצביעה על שגיאות במיטוזה וקשורה לקשירה לקויה של כרומוזומים למיקרוטובולים, פגמים בקומפלקסים של חלבונים האחראים על ספיגת הכרומוזומים והובלה, שגיאות בהפרדה של כרומוזומים ושגיאות בתיקון נזקי DNA38,39 ועשויה להיות קשורה לעקה חמצונית הנגרמת על ידי הדברה40,41. חריגות אחרות נצפו בכל הריכוזים שהוערכו. הגדלת ריכוזי ה-Cypermethrin הגדילה את הפרעות הגרעיניות באריתרוציטים ב-5% ו-20% במינונים הנמוכים ביותר (1 מיקרוגרם/ליטר) והגבוהים ביותר (20 מיקרוגרם/ליטר), בהתאמה. לדוגמה, לשינויים ב-DNA של מין יכולים להיות השלכות חמורות הן על ההישרדות בטווח הקצר והן בטווח הארוך, וכתוצאה מכך ירידה באוכלוסיה, שינוי בכושר הרבייה, הכלאה, אובדן מגוון גנטי ושינוי בשיעורי הגירה. כל הגורמים הללו יכולים להשפיע על הישרדות ותחזוקת המינים42,43. היווצרות של מומים אריתרואידים עלולה להצביע על חסימה בציטוקינזיס, וכתוצאה מכך חלוקת תאים לא תקינה (אריתרוציטים דו-גרעיניים)44,45; גרעינים מרובי אונות הם בליטות של הממברנה הגרעינית עם אונות מרובות46, בעוד שחריגות אריתרואידיות אחרות עשויות להיות קשורות להגברת DNA, כגון כליות/בלבים גרעיניים47. נוכחות של אריתרוציטים עם גרעיניים עשויה להצביע על פגיעה בהובלת חמצן, במיוחד במים מזוהמים48,49. אפופטוזיס מצביע על מוות של תאים50.
מחקרים אחרים הוכיחו גם את ההשפעות הגנוטוקסיות של cypermethrin. Kabaña et al.51 הדגימו נוכחות של מיקרו-גרעינים ושינויים גרעיניים כגון תאים דו-גרעיניים ותאים אפופטוטיים בתאי Odontophrynus americanus לאחר חשיפה לריכוזים גבוהים של cypermethrin (5000 ו-10,000 מיקרוגרם L-1) במשך 96 שעות. אפופטוזיס המושרה על ידי Cypermethrin זוהה גם ב-P. biligonigerus52 וב-Rhinella arenarum53. תוצאות אלו מצביעות על כך של-cypermethrin יש השפעות גנוטוקסיות על מגוון אורגניזמים מימיים וכי בדיקת MN ו-ENA עשויה להוות אינדיקטור להשפעות תת-קטלניות על דו-חיים ועשויה להיות ישימה על מינים מקומיים ואוכלוסיות בר הנחשפות לחומרים רעילים12.
תכשירים מסחריים של cypermethrin מהווים סכנה סביבתית גבוהה (הן אקוטית והן כרונית), כאשר מטה חורגים מרמת הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב (EPA)54 שעלולים להשפיע לרעה על המין אם הם נמצאים בסביבה. בהערכת הסיכון הכרוני, ה-NOEC לתמותה היה 3 מיקרוגרם L-1, מה שמאשר כי הריכוזים שנמצאו במים עשויים להוות סיכון למין55. ה-NOEC הקטלני עבור זחלי R. arenarum שנחשפו לתערובת של אנדוסולפן וציפרמטרין היה 500 מיקרוגרם L-1 לאחר 168 שעות; ערך זה ירד ל-0.0005 מיקרוגרם L-1 לאחר 336 שעות. המחברים מראים שככל שהחשיפה ארוכה יותר, כך יורדים הריכוזים המזיקים למין. כמו כן, חשוב להדגיש כי ערכי ה-NOEC היו גבוהים יותר מאלו של P. gracilis באותו זמן חשיפה, מה שמצביע על כך שתגובת המין ל-cypermethrin היא ספציפית למין. יתרה מכך, במונחים של תמותה, ערך CHQ של P. gracilis לאחר חשיפה ל-cypermethrin הגיע ל-64.67, שהוא גבוה מערך הייחוס שנקבע על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב54, וערך CHQ של זחלי R. arenarum היה גם גבוה מערך זה (CHQ > 388.00 לאחר 336 שעות), מה שמעיד על סיכון גבוה ל-amphibian. בהתחשב בכך ש-P. gracilis דורש כ-30 יום כדי להשלים את המטמורפוזה56, ניתן להסיק שהריכוזים הנחקרים של cypermethrin עשויים לתרום לירידה באוכלוסייה על ידי מניעת כניסה של פרטים נגועים לשלב הבוגר או הרבייה בגיל מוקדם.
בהערכת הסיכון המחושבת של מיקרו-גרעינים וחריגות גרעיניות אחרות של אריתרוציטים, ערכי CHQ נעו בין 14.92 ל-97.00, מה שמצביע על כך שלציפרמטרין היה סיכון גנוטוקסי פוטנציאלי ל-P. gracilis אפילו בסביבתו הטבעית. בהתחשב בתמותה, הריכוז המרבי של תרכובות קסנוביוטיות הנסבלות ל-P. gracilis היה 4.24 מיקרוגרם L-1. עם זאת, ריכוזים נמוכים של 1 מיקרוגרם/ליטר הראו גם השפעות גנוטוקסיות. עובדה זו עלולה להוביל לעלייה במספר הפרטים החריגים57 ולהשפיע על התפתחותם ורבייתם של מינים בבתי הגידול שלהם, ולהוביל לירידה באוכלוסיות הדו-חיים.
פורמולציות מסחריות של קוטל החרקים cypermethrin הראו רעילות חריפה וכרונית גבוהה ל-P. gracilis. נצפו שיעורי תמותה גבוהים יותר, ככל הנראה בשל השפעות רעילות, כפי שמעידה על נוכחותם של מיקרו-גרעינים וחריגויות גרעיניות אריתרוציטים, במיוחד גרעינים משוננים, גרעינים אונות וגרעינים שלפוחיתיים. בנוסף, המינים שנחקרו הראו סיכונים סביבתיים מוגברים, הן אקוטיים והן כרוניים. נתונים אלה, בשילוב עם מחקרים קודמים של קבוצת המחקר שלנו, הראו שאפילו תכשירים מסחריים שונים של cypermethrin עדיין גרמו לירידה בפעילות של אצטילכולין אסטראז (AChE) ו-butyrylcholinesterase (BChE) ולחץ חמצוני58, והביאו לשינויים בפעילות השחייה ומומים בפה59 ב-P. gracilis, מה שמעיד על כך שלמינים מסחריים ותת-פורמולציות של lethalpermethrin יש חומר רעיל זה. הרטמן וחב'. 60 מצאו שפורמולציות מסחריות של cypermethrin היו הרעילות ביותר ל-P. gracilis ולמין אחר מאותו הסוג (P. cuvieri) בהשוואה לתשעה חומרי הדברה אחרים. זה מצביע על כך שריכוזים מאושרים על פי חוק של cypermethrin לשמירה על הסביבה עלולים לגרום לתמותה גבוהה ולירידה באוכלוסיה לטווח ארוך.
דרושים מחקרים נוספים כדי להעריך את הרעילות של חומר ההדברה לדו-חיים, שכן הריכוזים המצויים בסביבה עלולים לגרום לתמותה גבוהה ולהוות סיכון פוטנציאלי ל-P. gracilis. יש לעודד מחקר על מיני דו-חיים, שכן נתונים על אורגניזמים אלה נדירים, במיוחד על מינים ברזילאים.
בדיקת הרעילות הכרונית נמשכה 168 שעות (7 ימים) בתנאים סטטיים והריכוזים התת-קטליים היו: 1, 3, 6 ו-20 מיקרוגרם ai L-1. בשני הניסויים, 10 ראשנים לקבוצת טיפול הוערכו עם שישה שכפולים, בסך הכל של 60 ראשנים לריכוז. בינתיים, הטיפול במים בלבד שימש בקרה שלילית. כל מערך ניסוי כלל צלחת זכוכית סטרילית עם קיבולת של 500 מ"ל וצפיפות של ראשן אחד לכל 50 מ"ל תמיסה. הבקבוק היה מכוסה בסרט פוליאתילן כדי למנוע אידוי ואוורר ברציפות.
המים נותחו כימית כדי לקבוע ריכוזי חומרי הדברה ב-0, 96 ו-168 שעות. לפי סבין ואח'. 68 ומרטינס et al. 69, הניתוחים בוצעו במעבדת ניתוח חומרי הדברה (LARP) של האוניברסיטה הפדרלית של סנטה מריה באמצעות כרומטוגרפיה של גז בשילוב ספקטרומטריית מסה משולשת קוואדרופול (Varian model 1200, Palo Alto, קליפורניה, ארה"ב). הקביעה הכמותית של חומרי הדברה במים מוצגת כחומר משלים (טבלה SM1).
עבור בדיקת מיקרו-גרעין (MNT) ובדיקת אבנורמליות גרעינית של תאים אדומים (RNA), נותחו 15 ראשנים מכל קבוצת טיפול. ראשנים הורדמו עם 5% לידוקאין (50 מ"ג g-170) ודגימות דם נאספו על ידי ניקור לב באמצעות מזרקים חד-פעמיים עם הפרין. מריחות דם הוכנו על שקופיות מיקרוסקופ סטריליות, מיובשות באוויר, קבועות עם 100% מתנול (4 מעלות צלזיוס) למשך 2 דקות, ולאחר מכן נצבעו בתמיסת Giemsa 10% למשך 15 דקות בחושך. בסוף התהליך, השקופיות נשטפו במים מזוקקים להסרת כתם עודף וייבשו בטמפרטורת החדר.
לפחות 1000 RBCs מכל ראשן נותחו באמצעות מיקרוסקופ 100× עם מטרה 71 כדי לקבוע את נוכחותם של MN ו-ENA. סך של 75,796 RBCs מהראשנים הוערכו בהתחשב בריכוזי סייפרמטרין ובבקרות. גנוטוקסיות נותחה לפי השיטה של ​​Carrasco et al. ו-Fenech et al.38,72 על ידי קביעת התדירות של הנגעים הגרעיניים הבאים: (1) תאים גרעיניים: תאים ללא גרעינים; (2) תאים אפופטוטיים: פיצול גרעיני, מוות תאי מתוכנת; (3) תאים דו-גרעיניים: תאים בעלי שני גרעינים; (4) ניצנים או תאים גרעיניים: תאים בעלי גרעינים בעלי בליטות קטנות של הממברנה הגרעינית, צלעות דומות בגודלן למיקרו-גרעינים; (5) תאים מקריוליזים: תאים עם קו מתאר הגרעין בלבד ללא חומר פנימי; (6) תאים מחורצים: תאים בעלי גרעינים בעלי סדקים או חריצים ברורים בצורתם, הנקראים גם גרעינים בצורת כליה; (7) תאים בעלי גוון: תאים בעלי בליטות גרעיניות גדולות מהשלפוחיות הנ"ל; ו-(8) מיקרו-תאים: תאים עם גרעינים דחוסים וציטופלזמה מופחתת. השינויים הושוו לתוצאות הבקרה השליליות.
תוצאות בדיקת הרעילות החריפה (LC50) נותחו באמצעות תוכנת GBasic ושיטת TSK-Trimmed Spearman-Karber74. נתוני הבדיקה הכרונית נבדקו מראש עבור תקינות שגיאה (Shapiro-Wilks) והומוגניות של שונות (Bartlett). התוצאות נותחו באמצעות אנליזה חד כיוונית של שונות (ANOVA). הבדיקה של Tukey שימשה להשוואת נתונים בינם לבין עצמם, והמבחן של דאנט שימש להשוואת נתונים בין קבוצת הטיפול לקבוצת הביקורת השלילית.
נתוני LOEC ו-NOEC נותחו באמצעות מבחן Dunnett. בדיקות סטטיסטיות בוצעו באמצעות תוכנת Statistica 8.0 (StatSoft) עם רמת מובהקות של 95% (p < 0.05).