השימוש הנרחב בחומרי הדברה סינתטיים הוביל לבעיות רבות, כולל הופעתם של אורגניזמים עמידים, פגיעה סביבתית ופגיעה בבריאות האדם. לכן, מיקרוביאלים חדשיםחומרי הדברהשבטוחים לבריאות האדם ולסביבה, יש צורך דחוף. במחקר זה, נעשה שימוש בחומר פעיל שטח ביולוגי מסוג רמנוליפיד המיוצר על ידי Enterobacter cloacae SJ2 כדי להעריך רעילות לזחלי יתושים (Culex quinquefasciatus) וטרמיטים (Odontotermes obesus). התוצאות הראו כי קיים שיעור תמותה תלוי מינון בין הטיפולים. ערך ה-LC50 (ריכוז קטלני של 50%) לאחר 48 שעות עבור חומרים פעילי שטח ביולוגיים של טרמיטים וזחלי יתושים נקבע באמצעות שיטת התאמת עקומת רגרסיה לא לינארית. התוצאות הראו כי ערכי LC50 לאחר 48 שעות (רווח בר-סמך של 95%) של הפעילות הקוטלת זחלים ואנטי-טרמיטים של החומר הפעיל שטח ביולוגי היו 26.49 מ"ג/ליטר (טווח 25.40 עד 27.57) ו-33.43 מ"ג/ליטר (טווח 31.09 עד 35.68) בהתאמה. על פי בדיקה היסטופתולוגית, טיפול בחומרים פעילי שטח ביולוגיים גרם נזק חמור לרקמות האברון של הזחלים והטרמיטים. תוצאות מחקר זה מצביעות על כך שהחומר הביולוגי פעיל השטח המיקרוביאלי המיוצר על ידי Enterobacter cloacae SJ2 הוא כלי מצוין ויעיל פוטנציאלית לבקרת Cx quinquefasciatus ו-O. obesus.
מדינות טרופיות חוות מספר רב של מחלות המועברות על ידי יתושים1. הרלוונטיות של מחלות המועברות על ידי יתושים נפוצה. יותר מ-400,000 איש מתים ממלריה מדי שנה, וכמה ערים גדולות חוות מגפות של מחלות קשות כמו קדחת דנגי, קדחת צהובה, צ'יקונגוניה וזיקה.2 מחלות המועברות על ידי וקטורים קשורות לאחד מכל שישה זיהומים ברחבי העולם, כאשר יתושים גורמים למקרים המשמעותיים ביותר3,4. Culex, Anopheles ו-Aedes הם שלושת סוגי היתושים הקשורים להעברת מחלות5. שכיחות קדחת הדנגי, זיהום המועבר על ידי יתוש Aedes aegypti, גדלה בעשור האחרון ומהווה איום משמעותי על בריאות הציבור4,7,8. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), יותר מ-40% מאוכלוסיית העולם נמצאת בסיכון לקדחת דנגי, כאשר 50-100 מיליון מקרים חדשים מתרחשים מדי שנה ביותר מ-100 מדינות9,10,11. קדחת דנגי הפכה לבעיה מרכזית בבריאות הציבור ככל ששכיחותה עלתה ברחבי העולם12,13,14. אנופלס גמביה, הידוע בכינויו יתוש האנופלס האפריקאי, הוא הווקטור החשוב ביותר של מלריה אנושית באזורים טרופיים וסובטרופיים15. נגיף הנילוס המערבי, דלקת המוח של סנט לואיס, דלקת המוח היפנית וזיהומים ויראליים של סוסים וציפורים מועברים על ידי יתושי Culex, המכונים לעתים קרובות יתושי בית נפוצים. בנוסף, הם גם נשאים של מחלות חיידקיות וטפיליות16. ישנם יותר מ-3,000 מינים של טרמיטים בעולם, והם קיימים כבר יותר מ-150 מיליון שנה17. רוב המזיקים חיים באדמה וניזונים מעץ ומוצרי עץ המכילים תאית. הטרמיט ההודי Odontotermes obesus הוא מזיק חשוב הגורם נזק חמור לגידולים חשובים ולעצי מטעים18. באזורים חקלאיים, נגיעות טרמיטים בשלבים שונים עלולה לגרום נזק כלכלי עצום לגידולים שונים, מיני עצים וחומרי בניין. טרמיטים יכולים גם לגרום לבעיות בריאותיות בבני אדם19.
סוגיית העמידות של מיקרואורגניזמים ומזיקים בתחומי התרופות והחקלאות של ימינו היא מורכבת20,21. לכן, שתי החברות צריכות לחפש אחר חומרים אנטי-מיקרוביאליים חדשים וחסכוניים וחומרי הדברה ביולוגיים בטוחים. חומרי הדברה סינתטיים זמינים כיום והוכחו כי הם מדבקים ודוחים חרקים מועילים שאינם מכוונים22. בשנים האחרונות, המחקר על חומרים פעילי שטח ביולוגיים התרחב עקב יישומם בתעשיות שונות. חומרים פעילי שטח ביולוגיים שימושיים וחיוניים מאוד בחקלאות, שיקום קרקע, הפקת נפט, הסרת חיידקים וחרקים ועיבוד מזון23,24. חומרים פעילי שטח ביולוגיים או חומרים פעילי שטח מיקרוביאליים הם כימיקלים ביולוגיים פעילי שטח המיוצרים על ידי מיקרואורגניזמים כמו חיידקים, שמרים ופטריות בבתי גידול חופיים ובאזורים מזוהמים בשמן25,26. חומרים פעילי שטח שמקורם כימית וחומרים פעילי שטח ביולוגיים הם שני סוגים המתקבלים ישירות מהסביבה הטבעית27. חומרים פעילי שטח ביולוגיים שונים מתקבלים מבתי גידול ימיים28,29. לכן, מדענים מחפשים טכנולוגיות חדשות לייצור חומרים פעילי שטח ביולוגיים המבוססים על חיידקים טבעיים30,31. התקדמות במחקר כזה מדגימה את חשיבותן של תרכובות ביולוגיות אלו להגנה על הסביבה32. Bacillus, Pseudomonas, Rhodococcus, Alcaligenes, Corynebacterium וסוגים חיידקיים אלו הם נציגים נחקרים היטב23,33.
ישנם סוגים רבים של חומרים פעילי שטח ביולוגיים עם מגוון רחב של יישומים34. יתרון משמעותי של תרכובות אלו הוא שלחלקן פעילות אנטיבקטריאלית, קוטלת זחלים וקוטלת חרקים. משמעות הדבר היא שניתן להשתמש בהן בתעשיות החקלאיות, הכימיות, התרופות והקוסמטיקה35,36,37,38. מכיוון שחומרים פעילי שטח ביולוגיים הם בדרך כלל מתכלים ביולוגית ומועילים לסביבה, הם משמשים בתוכניות משולבות להדברת מזיקים להגנה על גידולים39. לפיכך, הושג ידע בסיסי על הפעילות הקוטלת זחלים ואנטי-טרמיטים של חומרים פעילי שטח ביולוגיים מיקרוביאליים המיוצרים על ידי Enterobacter cloacae SJ2. בדקנו תמותה ושינויים היסטולוגיים בעת חשיפה לריכוזים שונים של חומרים פעילי שטח ביולוגיים מסוג רמנוליפיד. בנוסף, הערכנו את תוכנת המחשב הנפוצה QSAR (Quantitative Structure-Activity) ECological Structure-Activity (ECOSAR) כדי לקבוע רעילות חריפה עבור מיקרואצות, דפניה ודגים.
במחקר זה, נבדקה הפעילות האנטי-טרמיטית (רעילות) של חומרים פעילי שטח מטוהרים בריכוזים שונים הנעים בין 30 ל-50 מ"ג/מ"ל (במרווחים של 5 מ"ג/מ"ל) כנגד טרמיטים הודים, O. obesus והמין הרביעי). הערכת זחלי אינסטאר Cx. זחלי יתושים quinquefasciatus. ריכוזי LC50 של חומר פעיל שטח במשך 48 שעות כנגד O. obesus ו-Cx. C. solanacearum. זחלי יתושים זוהו באמצעות שיטת התאמת עקומת רגרסיה לא לינארית. התוצאות הראו שתמותת הטרמיטים עלתה עם עליית ריכוז חומר פעיל השטח. התוצאות הראו כי לחומר פעיל השטח הביולוגי הייתה פעילות קוטלת זחלים (איור 1) ופעילות נגד טרמיטים (איור 2), עם ערכי LC50 לאחר 48 שעות (רווח בר-סמך 95%) של 26.49 מ"ג/ליטר (25.40 עד 27.57) ו-33.43 מ"ג/ליטר (איור 31.09 עד 35.68), בהתאמה (טבלה 1). מבחינת רעילות חריפה (48 שעות), החומר הפעיל שטח הביולוגי מסווג כ"מזיק" לאורגניזמים שנבדקו. החומר הפעיל שטח הביולוגי שיוצר במחקר זה הראה פעילות קוטלת זחלים מצוינת עם תמותה של 100% תוך 24-48 שעות מחשיפה.
חשב את ערך LC50 לפעילות קוטלת זחלים. התאמת עקומת רגרסיה לא לינארית (קו רציף) ורווח בר-סמך של 95% (אזור מוצלל) לתמותה יחסית (%).
חשב את ערך LC50 לפעילות נגד טרמיטים. התאמת עקומת רגרסיה לא לינארית (קו רציף) ורווח בר-סמך 95% (אזור מוצלל) לתמותה יחסית (%).
בסוף הניסוי נצפו שינויים מורפולוגיים ואנומליות תחת מיקרוסקופ. שינויים מורפולוגיים נצפו בקבוצת הביקורת ובקבוצת המטופלים בהגדלה של פי 40. כפי שמוצג באיור 3, פגיעה בגדילה התרחשה ברוב הזחלים שטופלו בחומרים פעילי שטח ביולוגיים. איור 3א' מציג Cx. quinquefasciatus תקין, איור 3ב' מציג Cx. אנומלי גורם לחמישה זחלי נמטודות.
השפעת מינונים תת-קטלניים (LC50) של חומרים פעילי שטח ביולוגיים על התפתחות זחלי Culex quinquefasciatus. תמונה במיקרוסקופ אור (א) של Cx תקין בהגדלה של ×40. quinquefasciatus (ב) Cx חריג. גורם לחמישה זחלי נמטודות.
במחקר הנוכחי, בדיקה היסטולוגית של זחלים שטופלו (איור 4) וטרמיטים (איור 5) חשפה מספר חריגות, כולל הקטנה באזור הבטן ונזק לשרירים, לשכבות האפיתל ולעור באמצע המעי. היסטולוגיה חשפה את מנגנון הפעילות המעכבת של החומר הפעיל שטח ששימש במחקר זה.
היסטופתולוגיה של זחלי Cx בשלב הרביעי תקינים שלא טופלו. זחלי quinquefasciatus (ביקורת: (a,b)) שטופלו בחומר פעיל שטח ביולוגי (טיפול: (c,d)). חצים מצביעים על אפיתל המעי (epi), גרעינים (n) ושריר (mu) שטופלו. עמודה = 50 מיקרומטר.
היסטופתולוגיה של O. obesus תקין שלא מטופל (ביקורת: (a,b)) ושל ביוספקנט שטופל (טיפול: (c,d)). חצים מצביעים על אפיתל המעי (epi) ושריר (mu), בהתאמה. עמודה = 50 מיקרומטר.
במחקר זה, נעשה שימוש ב-ECOSAR כדי לחזות את הרעילות החריפה של תוצרי ביו-פעילי שטח מסוג רמנוליפיד ליצרנים ראשוניים (אצות ירוקות), צרכנים ראשוניים (פרעושי מים) וצרכנים משניים (דגים). תוכנית זו משתמשת במודלים כמותיים מתוחכמים של מבנה-פעילות של תרכובות כדי להעריך רעילות על סמך מבנה מולקולרי. המודל משתמש בתוכנת מבנה-פעילות (SAR) כדי לחשב את הרעילות החריפה והארוכת טווח של חומרים למינים ימיים. באופן ספציפי, טבלה 2 מסכמת את הריכוזים הקטלניים הממוצעים המשוערים (LC50) ואת הריכוזים האפקטיביים הממוצעים (EC50) עבור מספר מינים. רעילות חשודה סווגה לארבע רמות באמצעות המערכת המתואמת הגלובלית לסיווג ותיוג של כימיקלים (טבלה 3).
הדברה במחלות הנישאות על ידי וקטורים, במיוחד זנים של יתושים ויתושי Aedes. המצרים, כיום עבודה קשה 40,41,42,43,44,45,46. למרות שחלק מחומרי הדברה הזמינים כימית, כגון פירתרואידים ואורגנופוספטים, מועילים במידה מסוימת, הם מהווים סיכונים משמעותיים לבריאות האדם, כולל סוכרת, הפרעות רבייה, הפרעות נוירולוגיות, סרטן ומחלות נשימה. יתר על כן, עם הזמן, חרקים אלה יכולים להפוך עמידים להם 13,43,48. לפיכך, אמצעי הדברה ביולוגיים יעילים וידידותיים לסביבה יהפכו לשיטה פופולרית יותר להדברת יתושים 49,50. בנלי 51 הציעו כי הדברה מוקדמת של וקטורי יתושים תהיה יעילה יותר באזורים עירוניים, אך הם לא המליצו על שימוש בקוטלי זחלים באזורים כפריים 52. טום ועמיתיו 53 הציעו גם כי הדברת יתושים בשלבים הלא-בוגרים שלהם תהיה אסטרטגיה בטוחה ופשוטה מכיוון שהם רגישים יותר לחומרי הדברה 54.
ייצור חומרים פעילי שטח ביולוגיים על ידי זן חזק (Enterobacter cloacae SJ2) הראה יעילות עקבית ומבטיחה. מחקר קודם שלנו דיווח כי Enterobacter cloacae SJ2 מייעל את ייצור החומרים הפעילי שטח ביולוגיים באמצעות פרמטרים פיזיקוכימיים26. על פי המחקר שלהם, התנאים האופטימליים לייצור חומרים פעילי שטח ביולוגיים על ידי בידוד פוטנציאלי של E. cloacae היו דגירה למשך 36 שעות, ערבוב ב-150 סל"ד, pH 7.5, 37 מעלות צלזיוס, מליחות 1 ppt, 2% גלוקוז כמקור פחמן, 1% שמרים. התמצית שימשה כמקור חנקן לקבלת 2.61 גרם/ליטר חומר פעיל שטח ביולוגיים. בנוסף, החומרים הפעילי שטח הביולוגיים אופיינו באמצעות TLC, FTIR ו-MALDI-TOF-MS. ממצא זה אישר שרמנוליפיד הוא חומר פעיל שטח ביולוגיים. חומרים פעילי שטח ביולוגיים גליקוליפידים הם הסוג הנחקר ביותר מבין סוגים אחרים של חומרים פעילי שטח ביולוגיים55. הם מורכבים מחלקי פחמימות וליפידים, בעיקר שרשראות חומצות שומן. מבין הגליקוליפידים, הנציגים העיקריים הם רמנוליפיד וסופורוליפיד56. רמנוליפידים מכילים שתי קבוצות רמנוז המקושרות לחומצה מונו- או די-β-הידרוקסידקאנואית 57. השימוש ברמנוליפידים בתעשיות הרפואיות והפרמצבטיות מבוסס היטב 58, בנוסף לשימושם האחרון כקוטלי הדברה 59.
האינטראקציה של החומר הפעיל שטח ביולוגי עם האזור ההידרופובי של סיפון הנשימה מאפשרת למים לעבור דרך חלל הפיוניות שלו, ובכך מגבירה את המגע של הזחלים עם הסביבה המימית. נוכחותם של חומרים פעילי שטח ביולוגיים משפיעה גם על קנה הנשימה, שאורכו קרוב לפני השטח, מה שמקל על הזחלים לזחול אל פני השטח ולנשום. כתוצאה מכך, מתח הפנים של המים יורד. מכיוון שהזחלים אינם יכולים להיקשר לפני המים, הם נופלים לתחתית המיכל, ומשבשים את הלחץ ההידרוסטטי, וכתוצאה מכך להוצאת אנרגיה מוגזמת ולמוות כתוצאה מטביעה38,60. תוצאות דומות התקבלו על ידי Ghribi61, שם חומר פעיל שטח ביולוגי המיוצר על ידי Bacillus subtilis הראה פעילות קוטלת זחלים כנגד Ephestia kuehniella. באופן דומה, הפעילות הקוטלת זחלים של Cx. Das and Mukherjee23 העריכו גם את השפעת הליפופפטידים המחזוריים על זחלי quinquefasciatus.
תוצאות מחקר זה נוגעות לפעילות קוטלת הזחלים של חומרים פעילי שטח מסוג רמנוליפיד כנגד Cx. הריגת יתושי quinquefasciatus עולה בקנה אחד עם תוצאות שפורסמו בעבר. לדוגמה, נעשה שימוש בחומרים פעילי שטח מבוססי פעילי שטח המיוצרים על ידי חיידקים שונים מהסוג Bacillus ו-Pseudomonas spp. מספר דיווחים מוקדמים 64,65,66 דיווחו על פעילות קוטלת הזחלים של חומרים פעילי שטח ליפופפטידים מ-Bacillus subtilis 23. Deepali et al. 63 מצאו כי חומר פעיל שטח מסוג רמנוליפיד שבודד מ-Stenotropomonas maltophilia היה בעל פעילות קוטלת זחלים חזקה בריכוז של 10 מ"ג/ליטר. Silva et al. 67 דיווחו על הפעילות הקוטלת הזחלים של חומר פעיל שטח מסוג רמנוליפיד כנגד Ae בריכוז של 1 גרם/ליטר. Aedes aegypti. Kanakdande et al. 68 דיווחו כי חומרים ביולוגיים ליפופפטידיים המיוצרים על ידי Bacillus subtilis גרמו לתמותה כוללת בזחלי Culex ובטרמיטים עם החלק הליפופילי של אקליפטוס. באופן דומה, Masendra et al. 69 דיווחו על תמותה של 61.7% של נמלי פועלות (Cryptotermes cynocephalus Light.) בחלקים הליפופיליים של n-hexane ו-EtOAc של תמצית גולמית של E.
Parthipan ועמיתיו 70 דיווחו על שימוש בקוטלי חרקים בחומרים פעילי שטח ליפופפטידים המיוצרים על ידי Bacillus subtilis A1 ו-Pseudomonas stutzeri NA3 כנגד Anopheles Stephensi, וקטור של טפיל המלריה Plasmodium. הם הבחינו כי הזחלים והגלמים שרדו זמן רב יותר, היו בעלי תקופות הטלה קצרות יותר, היו עקרים ותוחלת חיים קצרה יותר כאשר טופלו בריכוזים שונים של חומרים פעילי שטח. ערכי LC50 שנצפו של חומר פעיל שטח A1 של B. subtilis היו 3.58, 4.92, 5.37, 7.10 ו-7.99 מ"ג/ליטר עבור מצבי זחל שונים (כלומר, זחלים I, II, III, IV ושלבי גלמים) בהתאמה. לשם השוואה, חומרים פעילי שטח עבור שלבי זחל I-IV ושלבי גלמים של Pseudomonas stutzeri NA3 היו 2.61, 3.68, 4.48, 5.55 ו-6.99 מ"ג/ליטר, בהתאמה. הפנולוגיה המאוחרת של הזחלים והגלמים ששרדו נחשבת כתוצאה של הפרעות פיזיולוגיות ומטבוליות משמעותיות הנגרמות על ידי טיפולים בקוטלי חרקים.
זן Wickerhamomyces anomalus CCMA 0358 מייצר חומר פעיל שטח ביולוגי עם פעילות קוטלת זחלים של 100% כנגד יתושי Aedes. מרווח זמן של 24 שעות ב-aegypti 38 היה גבוה יותר ממה שדווח על ידי סילבה ואחרים. חומר פעיל שטח ביולוגי המיוצר מ-Pseudomonas aeruginosa באמצעות שמן חמניות כמקור פחמן הוכח כהורג 100% מהזחלים תוך 48 שעות 67. Abinaya ואחרים 72 ו-Pradhan ואחרים 73 הדגימו גם את ההשפעות הקוטלות זחלים או חרקים של חומרים פעילי שטח המיוצרים על ידי מספר מבודדים של הסוג Bacillus. מחקר שפורסם בעבר על ידי סנתיל-נתן ואחרים מצא כי 100% מזחלי היתושים שנחשפו ללגונות צמחים צפויים למות. 74.
הערכת ההשפעות התת-קטלניות של קוטלי חרקים על ביולוגיה של חרקים היא קריטית עבור תוכניות ניהול מזיקים משולבות מכיוון שמינונים/ריכוזים תת-קטלניים אינם הורגים חרקים אך עשויים להפחית את אוכלוסיות החרקים בדורות הבאים על ידי שיבוש מאפיינים ביולוגיים10. סיקירה ועמיתיו 75 הבחינו בפעילות קוטלת זחלים מלאה (100% תמותה) של חומר פעיל שטח ביולוגי מסוג רמנוליפיד (300 מ"ג/מ"ל) כאשר נבדק בריכוזים שונים הנעים בין 50 ל-300 מ"ג/מ"ל. שלב הזחל של זני Aedes aegypti. הם ניתחו את השפעות הזמן עד למוות וריכוזים תת-קטלניים על הישרדות הזחל ופעילות השחייה. בנוסף, הם הבחינו בירידה במהירות השחייה לאחר 24-48 שעות של חשיפה לריכוזים תת-קטלניים של חומר פעיל שטח ביולוגי (למשל, 50 מ"ג/מ"ל ו-100 מ"ג/מ"ל). רעלים בעלי תפקידים תת-קטלניים מבטיחים נחשבים כיעילים יותר בגרימת נזק מרובה למזיקים שנחשפו76.
תצפיות היסטולוגיות של תוצאותינו מצביעות על כך שחומרים פעילי שטח ביולוגיים המיוצרים על ידי Enterobacter cloacae SJ2 משנים באופן משמעותי את רקמות זחלי היתושים (Cx. quinquefasciatus) והטרמיטים (O. obesus). אנומליות דומות נגרמו על ידי הכנות של שמן בזיליקום ב-An. gambiaes.s וב-An. arabica תוארו על ידי Ochola77. Kamaraj ועמיתיו78 תיארו גם את אותן אנומליות מורפולוגיות ב-An. זחלי סטפני נחשפו לננו-חלקיקי זהב. Vasantha-Srinivasan ועמיתיו79 דיווחו גם ששמן אתרי ארנק הרועים פגע קשות בלשכה ובשכבות האפיתל של Aedes albopictus. Aedes aegypti. Raghavendran ועמיתיו דיווחו שזחלי יתושים טופלו בתמצית תפטירית של 500 מ"ג/מ"ל של פטריית פניציליום מקומית. Ae מראים נזק היסטולוגי חמור. aegypti ו-Cx. שיעור תמותה 80. בעבר, Abinaya ועמיתיו נחקרו זחלי השלב הרביעי של An. סטפנזי ו-Ae. aegypti מצאו שינויים היסטולוגיים רבים ב-Aedes aegypti שטופלו באקסופוליסכרידים של B. licheniformis, כולל מעי כבד בקיבה, ניוון שרירים, נזק וחוסר ארגון של גנגליוני חוט העצב72. על פי Raghavendran ועמיתיו, לאחר טיפול בתמצית תפטירית של P. daleae, תאי אמצע המעי של יתושים שנבדקו (זחלי השלב הרביעי) הראו נפיחות של לומן המעי, ירידה בתוכן הבין-תאי וניוון גרעיני81. אותם שינויים היסטולוגיים נצפו בזחלי יתושים שטופלו בתמצית עלי אכינצאה, דבר המצביע על הפוטנציאל הקוטלי חרקים של התרכובות המטופלות50.
השימוש בתוכנת ECOSAR זכה להכרה בינלאומית82. מחקרים עדכניים מצביעים על כך שהרעילות החריפה של חומרים פעילי שטח ביולוגיים של ECOSAR למיקרו-אצות (C. vulgaris), דגים ופרעושי מים (D. magna) נופלת תחת קטגוריית ה"רעילות" שהוגדרה על ידי האומות המאוחדות83. מודל הרעילות האקולוגית של ECOSAR משתמש ב-SAR וב-QSAR כדי לחזות רעילות חריפה וארוכת טווח של חומרים, ולעתים קרובות משמש לחיזוי רעילות של מזהמים אורגניים82,84.
פאראפורמלדהיד, בופר נתרן פוספט (pH 7.4) וכל שאר הכימיקלים ששימשו במחקר זה נרכשו ממעבדות HiMedia, הודו.
ייצור חומרים פעילי שטח ביולוגיים בוצע בבקבוקוני ארלנמאייר של 500 מ"ל המכילים 200 מ"ל של מצע בושנל האס סטרילי בתוספת 1% נפט גולמי כמקור פחמן יחיד. תרבית מקדימה של Enterobacter cloacae SJ2 (1.4 × 104 CFU/מ"ל) הודבקה וגודלה על שייקר מסלולי ב-37 מעלות צלזיוס, 200 סל"ד למשך 7 ימים. לאחר תקופת הדגירה, חומר הפעילי שטח הביולוגי חולץ על ידי צנטריפוגה של מצע התרבית ב-3400×g למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס והנוזל העל-תכליתי שנוצר שימש למטרות סינון. הליכי האופטימיזציה ואפיון החומרים הפעילי שטח הביולוגיים אומצו ממחקר קודם שלנו.
זחלי Culex quinquefasciatus התקבלו מהמרכז ללימודים מתקדמים בביולוגיה ימית (CAS), פאלאנצ'יפטאי, טאמיל נאדו (הודו). הזחלים גודלו במיכלי פלסטיק מלאים במים מזוקקים בטמפרטורה של 27 ± 2°C ובפרק זמן אור של 12:12 (אור:חושך). זחלי היתושים ניזונו בתמיסת גלוקוז 10%.
זחלי Culex quinquefasciatus נמצאו בבורות ספיגה פתוחים ולא מוגנים. השתמשו בהנחיות סיווג סטנדרטיות כדי לזהות ולתרבית זחלים במעבדה85. ניסויים קוטלי זחלים בוצעו בהתאם להמלצות ארגון הבריאות העולמי86. SH. זחלי quinquefasciatus בשלב הרביעי נאספו במבחנים סגורים בקבוצות של 25 מ"ל ו-50 מ"ל עם מרווח אוויר של שני שלישים מקיבולתם. חומר פעיל שטח ביולוגי (0-50 מ"ג/מ"ל) נוסף לכל מבחנה בנפרד ואוחסן ב-25 מעלות צלזיוס. מבחנת הבקרה השתמשה רק במים מזוקקים (50 מ"ל). זחלים מתים נחשבו לאלו שלא הראו סימני שחייה במהלך תקופת הדגירה (12-48 שעות)87. חשב את אחוז תמותת הזחלים באמצעות המשוואה. (1)88.
משפחת ה-Odontotermitidae כוללת את הטרמיט ההודי Odontotermes obesus, שנמצא בבולי עץ נרקבים בקמפוס החקלאי (אוניברסיטת אנאמלאי, הודו). בדקו את החומר הביולוגי הזה (0-50 מ"ג/מ"ל) באמצעות נהלים רגילים כדי לקבוע אם הוא מזיק. לאחר ייבוש בזרימת אוויר למינרית במשך 30 דקות, כל רצועה של נייר Whatman צופתה בחומר ביולוגי בריכוז של 30, 40 או 50 מ"ג/מ"ל. רצועות נייר מצופות מראש ולא מצופות נבדקו והושוו במרכז צלחת פטרי. כל צלחת פטרי מכילה כשלושים טרמיטים פעילים O. obesus. טרמיטים לביקורת ולניסוי קיבלו נייר רטוב כמקור מזון. כל הצלחות נשמרו בטמפרטורת החדר לאורך כל תקופת הדגירה. טרמיטים מתו לאחר 12, 24, 36 ו-48 שעות89,90. לאחר מכן נעשה שימוש במשוואה 1 כדי להעריך את אחוז תמותת הטרמיטים בריכוזי חומר ביולוגי שונים. (2).
הדגימות נשמרו על קרח ונארזו במיקרו-צינורות המכילים 100 מ"ל של בופר נתרן פוספט 0.1 M (pH 7.4) ונשלחו למעבדה המרכזית לפתולוגיה של חקלאות ימית (CAPL) של מרכז רג'יב גנדי לחקלאות ימית (RGCA). מעבדת היסטולוגיה, סירקלי, מחוז מאילאדוטוראי, טאמיל נאדו, הודו לניתוח נוסף. הדגימות קובעו מיד בפאראפורמלדהיד 4% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות.
לאחר שלב הקיבוע, החומר נשטף שלוש פעמים עם תמיסת נתרן פוספט 0.1 M (pH 7.4), מיובש בשלבים באתנול והושרה בשרף LEICA למשך 7 ימים. לאחר מכן החומר הוכנס לתבנית פלסטיק מלאה בשרף ובפולימריזטור, ולאחר מכן הוכנס לתנור שחומם ל-37 מעלות צלזיוס עד שהבלוק המכיל את החומר עבר פולימריזציה מלאה.
לאחר הפולימריזציה, הבלוקים נחתכו באמצעות מיקרוטום LEICA RM2235 (Rankin Biomedical Corporation 10,399 Enterprise Dr. Davisburg, MI 48,350, USA) לעובי של 3 מ"מ. החתכים מקובצים על גבי שקופיות, עם שישה חתכים בכל שקופית. השקופיות יובשו בטמפרטורת החדר, לאחר מכן נצבעו בהמטוקסילין למשך 7 דקות ונשטפו במים זורמים למשך 4 דקות. בנוסף, יש למרוח את תמיסת האאוזין על העור למשך 5 דקות ולשטוף במים זורמים למשך 5 דקות.
רעילות חריפה ניבאה באמצעות אורגניזמים מימיים מרמות טרופיות שונות: LC50 לדגים למשך 96 שעות, LC50 לדיאטה מגנה למשך 48 שעות, ו-EC50 לאצות ירוקות למשך 96 שעות. הרעילות של חומרים פעילי שטח ביולוגיים מסוג רמנוליפיד לדגים ולאצות ירוקות הוערכה באמצעות תוכנת ECOSAR גרסה 2.2 עבור Windows שפותחה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב. (זמין באינטרנט בכתובת https://www.epa.gov/tsca-screening-tools/ecological-struct-activity-relationships-ecosar-predictive-model).
כל הבדיקות לפעילות קוטלת זחלים ופעילות נוגדת טרמיטים בוצעו בשלושה עותקים. בוצעה רגרסיה לא לינארית (לוגריתם של משתני תגובת מינון) של נתוני תמותת זחלים וטרמיטים כדי לחשב ריכוז קטלני חציוני (LC50) עם רווח בר-סמך של 95%, ועקומות תגובת ריכוז נוצרו באמצעות Prism® (גרסה 8.0, GraphPad Software) Inc., ארה"ב) 84, 91.
המחקר הנוכחי חושף את הפוטנציאל של חומרים פעילי שטח מיקרוביאליים המיוצרים על ידי Enterobacter cloacae SJ2 כגורמים קוטלי זחלים ונוגדי טרמיטים נגד יתושים, ועבודה זו תתרום להבנה טובה יותר של מנגנוני הפעולה הקוטלת זחלים ונוגדי טרמיטים. מחקרים היסטולוגיים של זחלים שטופלו בחומרים פעילי שטח הראו נזק למערכת העיכול, למרכז המעי, לקליפת המוח והיפרפלזיה של תאי אפיתל המעי. תוצאות: הערכה טוקסיקולוגית של הפעילות האנטי-טרמיטית והקוטלת זחלים של חומר פעיל שטח רמנוליפידי המיוצר על ידי Enterobacter cloacae SJ2 גילתה כי מבודד זה הוא קוטל חרקים ביולוגי פוטנציאלי לשליטה במחלות הנישאות על ידי וקטורים של יתושים (Cx quinquefasciatus) וטרמיטים (O. obesus). יש צורך להבין את הרעילות הסביבתית הבסיסית של חומרים פעילי שטח ביולוגיים ואת ההשפעות הסביבתיות הפוטנציאליות שלהם. מחקר זה מספק בסיס מדעי להערכת הסיכון הסביבתי של חומרים פעילי שטח ביולוגיים.
זמן פרסום: 09-04-2024