זיהוי כלל הגנום וניתוח ביטוי של גורמי ויסות צמיחת חרדל בתנאי בצורת

התפלגות המשקעים העונתית במחוז גוויג'ואו אינה אחידה, עם יותר משקעים באביב ובקיץ, אך שתילי הלפתית רגישים ללחץ בצורת בסתיו ובחורף, מה שמשפיע באופן חמור על היבול. חרדל הוא גידול זרעי שמן מיוחד הגדל בעיקר במחוז גוויג'ואו. יש לו סבילות חזקה לבצורת וניתן לגדל אותו באזורים הרריים. זהו משאב עשיר של גנים עמידים לבצורת. לגילוי גנים עמידים לבצורת יש חשיבות קריטית לשיפור זני החרדל. וחדשנות במשאבי גרמפלזמה. משפחת ה-GRF ממלאת תפקיד קריטי בצמיחה והתפתחות של צמחים ובתגובה ללחץ בצורת. כיום נמצאו גנים של GRF בארבידופסיס 2, אורז (Oryza sativa) 12, לפתית 13, כותנה (Gossypium hirsutum) 14, חיטה (Triticum). aestivum)15, דוחן פנינה (Setaria italica)16 ו-Brassica17, אך אין דיווחים על גנים של GRF שזוהו בחרדל. במחקר זה, הגנים של משפחת ה-GRF של חרדל זוהו ברמת הגנום והמאפיינים הפיזיקליים והכימיים שלהם, יחסים אבולוציוניים, הומולוגיה, מוטיבים משומרים, מבנה גנים, כפילות גנים, יסודות cis ושלב השתיל (שלב ארבעת העלים). דפוסי הביטוי תחת לחץ בצורת נותחו באופן מקיף כדי לספק בסיס מדעי למחקרים נוספים על התפקוד הפוטנציאלי של גנים BjGRF בתגובה לבצורת וכדי לספק גנים מועמדים לגידול חרדל עמיד לבצורת.
34 גנים של BjGRF זוהו בגנום Brassica juncea באמצעות שני חיפושי HMMER, כולם מכילים את התחומים QLQ ו-WRC. רצפי ה-CDS של גנים BjGRF שזוהו מוצגים בטבלה משלימה S1. BjGRF01–BjGRF34 נקראים על סמך מיקומם על הכרומוזום. המאפיינים הפיזיקליים-כימיים של משפחה זו מצביעים על כך שאורך חומצת האמינו משתנה מאוד, ונע בין 261 aa (BjGRF19) ל-905 aa (BjGRF28). הנקודה האיזואלקטרית של BjGRF נעה בין 6.19 (BjGRF02) ל-9.35 (BjGRF03) עם ממוצע של 8.33, ו-88.24% מה-BjGRF הוא חלבון בסיסי. טווח המשקל המולקולרי החזוי של BjGRF הוא מ-29.82 kDa (BjGRF19) ל-102.90 kDa (BjGRF28); מדד חוסר היציבות של חלבוני BjGRF נע בין 51.13 (BjGRF08) ל-78.24 (BjGRF19), כולם גדולים מ-40, מה שמעיד על כך שמדד חומצות השומן נע בין 43.65 (BjGRF01) ל-78.78 (BjVYGRF22) טווח הידרופיליות ממוצעת (-07). (BjGRF31) עד -0.45 (BjGRF22), לכל חלבוני BjGRF ההידרופיליים יש ערכי GRAVY שליליים, שעשויים לנבוע מהיעדר הידרופוביות הנגרמת מהשאריות. חיזוי לוקליזציה תת-תאית הראה שניתן למקם 31 חלבונים מקודדים BjGRF בגרעין, BjGRF04 יכול להיות מקומי בפרוקסיזומים, BjGRF25 יכול להיות מקומי בציטופלזמה, ו-BjGRF28 יכול להיות מקומי בכלורופלסטים (טבלה 1), מה שמצביע על כך ש-BjGRF יכול להיות תפקיד חשוב בגרעין. גורם שעתוק.
ניתוח פילוגנטי של משפחות GRF במינים שונים יכול לעזור לחקור את תפקודי הגנים. לכן, הורדו רצפי חומצות האמינו באורך מלא של 35 זרעי לפתית, 16 לפת, 12 אורז, 10 דוחן ו-9 Arabidopsis GRFs ועץ פילוגנטי נבנה על בסיס 34 גנים BjGRF מזוהים (איור 1). שלוש תת המשפחות מכילות מספר שונה של חברים; 116 GRF TFs מחולקים לשלוש תת-משפחות שונות (קבוצות A~C), המכילות 59 (50.86%), 34 (29.31%) ו-23 (19.83)% מה-GRF, בהתאמה. ביניהם, 34 בני משפחת BjGRF מפוזרים על פני 3 תת-משפחות: 13 חברים בקבוצה A (38.24%), 12 חברים בקבוצה B (35.29%) ו-9 חברים בקבוצה C (26.47%). בתהליך של polyploidization של חרדל, מספר הגנים של BjGRFs בתת-משפחות שונות שונה, וייתכן שהתרחשו הגברה ואובדן גנים. ראוי לציין כי אין התפלגות של GRF של אורז ודוחן בקבוצה C, בעוד שיש 2 GRF של אורז ו-1 GRF של דוחן בקבוצה B, ורוב ה-GRF של אורז ודוחן מקובצים בענף אחד, מה שמעיד על כך ש-BjGRF קשורים קשר הדוק לדקוטים. ביניהם, המחקרים המעמיקים ביותר על תפקוד ה-GRF ב- Arabidopsis thaliana מספקים בסיס למחקרים תפקודיים של BjGRFs.
עץ פילוגנטי של חרדל כולל Brassica napus, Brassica napus, אורז, דוחן ובני משפחת Arabidopsis thaliana GRF.
ניתוח של גנים חוזרים במשפחת החרדל GRF. הקו האפור ברקע מייצג בלוק מסונכרן בגנום החרדל, הקו האדום מייצג זוג חזרות מפולחות של הגן BjGRF;
ביטוי גנים BjGRF תחת לחץ בצורת בשלב העלה הרביעי. נתוני qRT-PCR מוצגים בטבלה משלימה S5. הבדלים משמעותיים בנתונים מסומנים באותיות קטנות.
ככל שהאקלים הגלובלי ממשיך להשתנות, לימוד כיצד יבולים מתמודדים עם לחץ בצורת ושיפור מנגנוני הסובלנות שלהם הפכו לנושא מחקר חם18. לאחר הבצורת ישתנו המבנה המורפולוגי, ביטוי הגנים והתהליכים המטבוליים של הצמחים, מה שעלול להוביל להפסקת הפוטוסינתזה והפרעה מטבולית, המשפיעים על היבול ועל איכות היבולים19,20,21. כאשר צמחים חשים באותות בצורת, הם מייצרים שליחים שניים כגון Ca2+ ו-phosphatidylinositol, מגבירים את ריכוז יוני הסידן התוך-תאיים ומפעילים את הרשת הרגולטורית של מסלול זרחון חלבון22,23. חלבון המטרה הסופי מעורב ישירות בהגנה התאית או מווסת את הביטוי של גנים הקשורים ללחץ באמצעות TFs, מה שמגביר את סבילות הצמח ללחץ24,25. לפיכך, TFs ממלאים תפקיד מכריע בתגובה ללחץ בצורת. על פי הרצף ותכונות הקישור ל-DNA של TFs המגיבים ללחץ בצורת, TFs ניתן לחלק למשפחות שונות, כגון GRF, ERF, MYB, WRKY ומשפחות אחרות26.
משפחת הגנים GRF היא סוג של TF ספציפי לצמח הממלא תפקידים חשובים בהיבטים שונים כגון צמיחה, התפתחות, העברת אותות ותגובות הגנת הצמח27. מאז שזוהה הגן GRF הראשון ב-O. sativa28, יותר ויותר גנים של GRF זוהו במינים רבים והוכחו כמשפיעים על צמיחת צמחים, התפתחות ותגובת לחץ8, 29, 30,31,32. עם פרסום רצף הגנום Brassica juncea, זיהוי משפחת הגנים BjGRF התאפשר33. במחקר זה, 34 גנים BjGRF זוהו בגנום החרדל כולו ונקראו BjGRF01-BjGRF34 על סמך מיקומם הכרומוזומלי. כולם מכילים תחומי QLQ ו-WRC שמורים מאוד. ניתוח המאפיינים הפיזיקליים-כימיים הראה שההבדלים במספר חומצות האמינו ובמשקל המולקולרי של חלבוני BjGRF (למעט BjGRF28) לא היו משמעותיים, מה שמצביע על כך שלבני משפחת BjGRF עשויים להיות פונקציות דומות. ניתוח מבנה גנים הראה ש-64.7% מהגנים BjGRF הכילו 4 אקסונים, מה שמצביע על כך שמבנה הגן BjGRF נשמר יחסית באבולוציה, אך מספר האקסונים בגנים BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ו-BjGRF29 גדול יותר. מחקרים הראו שהוספה או מחיקה של אקסונים או אינטרונים יכולים להוביל להבדלים במבנה ובתפקוד הגנים, ובכך ליצור גנים חדשים34,35,36. לכן, אנו משערים שהאינטרון של BjGRF אבד במהלך האבולוציה, מה שעלול לגרום לשינויים בתפקוד הגנים. בהתאם למחקרים קיימים, מצאנו גם שמספר האינטרונים היה קשור לביטוי גנים. כאשר מספר האינטרונים בגן גדול, הגן יכול להגיב במהירות לגורמים לא חיוביים שונים.
שכפול גנים הוא גורם מרכזי באבולוציה הגנומית והגנטית37. מחקרים קשורים הראו ששכפול גנים לא רק מגדיל את מספר הגנים של GRF, אלא גם משמש כאמצעי ליצירת גנים חדשים כדי לעזור לצמחים להסתגל לתנאים סביבתיים שליליים שונים38. בסך הכל נמצאו במחקר זה 48 זוגות גנים כפולים, כולם היו כפילויות מקטעיות, מה שמעיד על כך שכפילויות מגזריות הן המנגנון העיקרי להגדלת מספר הגנים במשפחה זו. דווח בספרות כי שכפול סגמנטלי יכול לקדם ביעילות את ההגברה של בני משפחת גן GRF בארבידופסיס ותות, ולא נמצאה שכפול טנדם של משפחת גנים זו באף אחד מהמינים27,39. תוצאות מחקר זה עולות בקנה אחד עם מחקרים קיימים על משפחות Arabidopsis thaliana ותותים, מה שמצביע על כך שמשפחת GRF יכולה להגדיל את מספר הגנים וליצור גנים חדשים באמצעות שכפול מקטעי בצמחים שונים.
במחקר זה זוהו בחרדל בסך הכל 34 גנים BjGRF, אשר חולקו ל-3 תת-משפחות. גנים אלה הראו מוטיבים ומבני גנים משומרים דומים. ניתוח קולינאריות גילה 48 זוגות של כפילות מקטעים בחרדל. אזור מקדם BjGRF מכיל אלמנטים הפועלים ב-cis הקשורים לתגובת אור, תגובה הורמונלית, תגובת לחץ סביבתי וצמיחה והתפתחות. הביטוי של 34 גנים BjGRF זוהה בשלב שתיל החרדל (שורשים, גבעולים, עלים), ודפוס הביטוי של 10 גנים BjGRF בתנאי בצורת. נמצא כי דפוסי הביטוי של גנים BjGRF תחת לחץ בצורת היו דומים ועשויים להיות דומים. מעורבות בבצורת כופה רגולציה. גנים BjGRF03 ו-BjGRF32 עשויים למלא תפקידים רגולטוריים חיוביים בלחץ בצורת, בעוד BjGRF06 ו-BjGRF23 ממלאים תפקידים בלחץ בצורת כגנים מטרה של miR396. בסך הכל, המחקר שלנו מספק בסיס ביולוגי לגילוי עתידי של תפקוד הגן BjGRF בצמחי Brassicaceae.
זרעי החרדל ששימשו בניסוי זה סופקו על ידי המכון למחקר זרעי שמן של Guizhou, Guizhou Academy of Agricultural Sciences. בחרו את הזרעים השלמים ושתלו אותם באדמה (מצע: אדמה = 3:1), ואספו את השורשים, הגבעולים והעלים לאחר שלב ארבעת העלים. הצמחים טופלו ב-20% PEG 6000 כדי לדמות בצורת, והעלים נאספו לאחר 0, 3, 6, 12 ו-24 שעות. כל דגימות הצמח הוקפאו מיד בחנקן נוזלי ולאחר מכן אוחסנו במקפיא -80 מעלות צלזיוס לבדיקה הבאה.
כל הנתונים שהושגו או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר שפורסם ובקבצי מידע משלים.