זיהוי כלל-גנומי וניתוח ביטוי של גורמי ויסות גדילת חרדל בתנאי בצורת

פיזור המשקעים העונתי במחוז גוויג'ואו אינו אחיד, עם יותר משקעים באביב ובקיץ, אך שתילי הלפתית רגישים לעקה בצורת בסתיו ובחורף, דבר המשפיע קשות על היבול. חרדל הוא גידול שמן מיוחד הגדל בעיקר במחוז גוויג'ואו. יש לו עמידות חזקה לבצורת וניתן לגדל אותו באזורים הרריים. זהו משאב עשיר של גנים עמידים לבצורת. גילוי גנים עמידים לבצורת הוא בעל חשיבות קריטית לשיפור זני חרדל ולחדשנות במשאבי נבט. משפחת ה-GRF ממלאת תפקיד קריטי בגדילת והתפתחות צמחים ובתגובה לעקה בצורת. נכון לעכשיו, גנים של GRF נמצאו בארבידופסיס 2, אורז (Oryza sativa) 12, לפתית 13, כותנה (Gossypium hirsutum) 14, חיטה (Triticum aestivum) 15, דוחן פנינה (Setaria italica) 16 ו-Brassica 17, אך אין דיווחים על גנים של GRF שזוהו בחרדל. במחקר זה, זוהו גני משפחת GRF של חרדל ברמה הגנומית כולה, ונותחו המאפיינים הפיזיקליים והכימיים שלהם, קשרים אבולוציוניים, הומולוגיה, מוטיבים שמורים, מבנה גנים, כפילויות גנים, יסודות ציס ושלב שתיל (שלב ארבעת העלים). דפוסי הביטוי תחת עקת בצורת נותחו באופן מקיף על מנת לספק בסיס מדעי למחקרים נוספים על התפקוד הפוטנציאלי של גני BjGRF בתגובת בצורת ולספק גנים מועמדים לגידול חרדל עמיד לבצורת.
שלושים וארבעה גנים של BjGRF זוהו בגנום של Brassica juncea באמצעות שני חיפושי HMMER, שכולם מכילים את הדומיינים QLQ ו-WRC. רצפי ה-CDS של גני ה-BjGRF שזוהו מוצגים בטבלה המשלימה S1. BjGRF01-BjGRF34 מקבלים את שמם על סמך מיקומם על הכרומוזום. התכונות הפיזיקוכימיות של משפחה זו מצביעות על כך שאורך חומצות האמינו משתנה מאוד, ונע בין 261 חומצות אמינו (BjGRF19) ל-905 חומצות אמינו (BjGRF28). הנקודה האיזואלקטרית של BjGRF נעה בין 6.19 (BjGRF02) ל-9.35 (BjGRF03) עם ממוצע של 8.33, ו-88.24% מ-BjGRF הוא חלבון בסיסי. טווח המשקל המולקולרי החזוי של BjGRF הוא בין 29.82 kDa (BjGRF19) ל-102.90 kDa (BjGRF28); מדד חוסר היציבות של חלבוני BjGRF נע בין 51.13 (BjGRF08) ל-78.24 (BjGRF19), כולם גדולים מ-40, דבר המצביע על כך שמדד חומצות השומן נע בין 43.65 (BjGRF01) ל-78.78 (BjGRF22), ההידרופיליות הממוצעת (GRAVY) נעה בין -1.07 (BjGRF31) ל- -0.45 (BjGRF22), לכל חלבוני ה-BjGRF ההידרופיליים יש ערכי GRAVY שליליים, שיכולים להיות בגלל חוסר הידרופוביות הנגרמת על ידי השאריות. ניבוי לוקליזציה תת-תאית הראה כי 31 חלבונים המקודדים על ידי BjGRF יכולים להיות ממוקמים בגרעין, BjGRF04 יכול להיות ממוקם בפרוקסיזומים, BjGRF25 יכול להיות ממוקם בציטופלזמה, ו-BjGRF28 יכול להיות ממוקם בכלורופלסטים (טבלה 1), דבר המצביע על כך ש-BjGRFs עשויים להיות ממוקמים בגרעין ולמלא תפקיד רגולטורי חשוב כגורם שעתוק.
ניתוח פילוגנטי של משפחות GRF במינים שונים יכול לסייע בחקר תפקודי גנים. לכן, הורדו רצפי חומצות האמינו באורך מלא של 35 גנים של קנולה, 16 גנים של לפת, 12 גנים של אורז, 10 גנים של דוחן ו-9 גנים של ארבידופסיס, ונבנה עץ פילוגנטי המבוסס על 34 גנים של BjGRF שזוהו (איור 1). שלוש תת-המשפחות מכילות מספר שונה של חברים; 116 גנים של GRF מחולקים לשלוש תת-משפחות שונות (קבוצות A~C), המכילות 59 (50.86%), 34 (29.31%) ו-23 (19.83)% מה-GRF, בהתאמה. מביניהן, 34 בני משפחת BjGRF מפוזרים על פני 3 תת-משפחות: 13 חברים בקבוצה A (38.24%), 12 חברים בקבוצה B (35.29%) ו-9 חברים בקבוצה C (26.47%). בתהליך פוליפלואידיזציה של חרדל, מספר הגנים של BjGRFs בתת-משפחות שונות שונה, וייתכן שהתרחשה הגברה ואובדן גנים. ראוי לציין כי אין תפוצה של GRFs של אורז ודוחן בקבוצה C, בעוד שבקבוצה B ישנם 2 GRFs של אורז ו-GRF אחד של דוחן, ורוב GRFs של האורז והדוחן מקובצים לענף אחד, דבר המצביע על כך ש-BjGRFs קשורים קשר הדוק לעצים דו-קוטבים. ביניהם, המחקרים המעמיקים ביותר על תפקוד ה-GRF בארבידופסיס תליאנה מספקים בסיס למחקרים פונקציונליים של BjGRFs.
עץ פילוגנטי של חרדל הכולל את Brassica napus, Brassica napus, אורז, דוחן וחברים ממשפחת Arabidopsis thaliana GRF.
ניתוח גנים חוזרים במשפחת גן החרדל GRF. הקו האפור ברקע מייצג בלוק מסונכרן בגנום החרדל, הקו האדום מייצג זוג גנים חוזרים מפולחים של גן BjGRF;
ביטוי גן BjGRF תחת עקת בצורת בשלב העלה הרביעי. נתוני qRT-PCR מוצגים בטבלה המשלימה S5. הבדלים משמעותיים בנתונים מסומנים באותיות קטנות.
ככל שהאקלים העולמי ממשיך להשתנות, חקר התמודדות גידולים עם עקת בצורת ושיפור מנגנוני הסבילות שלהם הפך לנושא מחקר חם18. לאחר בצורת, המבנה המורפולוגי, ביטוי הגנים ותהליכים מטבוליים של צמחים ישתנו, מה שעלול להוביל להפסקת הפוטוסינתזה ולהפרעה מטבולית, דבר המשפיע על היבול ואיכות הגידולים19,20,21. כאשר צמחים חשים אותות בצורת, הם מייצרים שליחים שניים כגון Ca2+ ופוספטידילינוזיטול, מגבירים את ריכוז יוני הסידן התוך תאיים ומפעילים את הרשת הרגולטורית של מסלול זרחון החלבונים22,23. חלבון המטרה הסופי מעורב ישירות בהגנה תאית או מווסת את הביטוי של גנים קשורים ללחץ דרך חלבוני תהודה (TFs), מה שמשפר את הסבילות של הצמח ללחץ24,25. לפיכך, חלבוני תהודה ממלאים תפקיד מכריע בתגובה לעקת בצורת. בהתאם לרצף ולתכונות קישור ה-DNA של חלבוני תהודה המגיבים לעקת בצורת, ניתן לחלק את חלבוני התהודה למשפחות שונות, כגון GRF, ERF, MYB, WRKY ומשפחות אחרות26.
משפחת הגנים GRF היא סוג של גן טרנספורמטיבי ספציפי לצמח, אשר ממלא תפקידים חשובים בהיבטים שונים כגון צמיחה, התפתחות, העברת אותות ותגובות הגנה של הצמחים27. מאז שזוהה גן ה-GRF הראשון ב-O. sativa28, זוהו עוד ועוד גנים של GRF במינים רבים והוכח כי הם משפיעים על גדילת הצמח, התפתחותו ותגובתו ללחץ8, 29, 30,31,32. עם פרסום רצף הגנום של Brassica juncea, זיהוי משפחת הגנים BjGRF התאפשר33. במחקר זה, זוהו 34 גנים של BjGRF בכל גנום החרדל ונקראו BjGRF01-BjGRF34 בהתבסס על מיקומם הכרומוזומלי. כולם מכילים דומיינים QLQ ו-WRC שמורים מאוד. ניתוח התכונות הפיזיקוכימיות הראה כי ההבדלים במספר חומצות האמינו ובמשקלים המולקולריים של חלבוני BjGRF (למעט BjGRF28) לא היו משמעותיים, דבר המצביע על כך שלבני משפחת BjGRF עשויים להיות פונקציות דומות. ניתוח מבנה הגנים הראה כי 64.7% מגני BjGRF הכילו 4 אקסונים, דבר המצביע על כך שמבנה הגן BjGRF נשמר יחסית באבולוציה, אך מספר האקסונים בגנים BjGRF10, BjGRF16, BjGRP28 ו-BjGRF29 גדול יותר. מחקרים הראו כי הוספה או מחיקה של אקסונים או אינטרונים יכולות להוביל להבדלים במבנה ובתפקוד הגנים, ובכך ליצור גנים חדשים34,35,36. לכן, אנו משערים כי האינטרון של BjGRF אבד במהלך האבולוציה, מה שעשוי לגרום לשינויים בתפקוד הגנים. בהתאם למחקרים קיימים, מצאנו גם כי מספר האינטרונים היה קשור לביטוי גנים. כאשר מספר האינטרונים בגן גדול, הגן יכול להגיב במהירות לגורמים שליליים שונים.
שכפול גנים הוא גורם מרכזי באבולוציה גנומית וגנטית37. מחקרים קשורים הראו שכפול גנים לא רק מגדיל את מספר הגנים של GRF, אלא גם משמש כאמצעי ליצירת גנים חדשים המסייעים לצמחים להסתגל לתנאי סביבה קשים שונים38. בסך הכל נמצאו 48 זוגות גנים כפולים במחקר זה, כולם היו שכפולים סגמנטליים, דבר המצביע על כך שכפולים סגמנטליים הם המנגנון העיקרי להגדלת מספר הגנים במשפחה זו. דווח בספרות ששכפול סגמנטלי יכול לקדם ביעילות את ההגברה של בני משפחת הגנים של GRF בארבידופסיס ובתות שדה, ולא נמצאה שכפול טנדם של משפחת גנים זו באף אחד מהמינים27,39. תוצאות מחקר זה עולות בקנה אחד עם מחקרים קיימים על משפחות ארבידופסיס ת'ליאנה ותות שדה, דבר המצביע על כך שמשפחת GRF יכולה להגדיל את מספר הגנים וליצור גנים חדשים באמצעות שכפול סגמנטלי בצמחים שונים.
במחקר זה, זוהו סך של 34 גנים של BjGRF בחרדל, אשר חולקו לשלוש תת-משפחות. גנים אלה הראו מוטיבים ומבני גנים שמורים דומים. ניתוח קולינאריות גילה 48 זוגות של כפילויות מקטע בחרדל. אזור הפרומוטר של BjGRF מכיל אלמנטים cis-acting הקשורים לתגובת אור, תגובה הורמונלית, תגובת עקה סביבתית, צמיחה והתפתחות. הביטוי של 34 גנים של BjGRF זוהה בשלב שתיל החרדל (שורשים, גבעולים, עלים), ודפוס הביטוי של 10 גנים של BjGRF בתנאי בצורת. נמצא כי דפוסי הביטוי של גנים של BjGRF תחת עקת בצורת היו דומים וייתכן שהם מעורבים בוויסות כפיית בצורת. גנים של BjGRF03 ו-BjGRF32 עשויים למלא תפקידים רגולטוריים חיוביים בעקת בצורת, בעוד ש-BjGRF06 ו-BjGRF23 ממלאים תפקידים בעקת בצורת כגנים מטרה של miR396. בסך הכל, המחקר שלנו מספק בסיס ביולוגי לגילוי עתידי של תפקוד גן BjGRF בצמחי כרוב.
זרעי החרדל ששימשו בניסוי זה סופקו על ידי מכון המחקר של זרעי שמן בגוויג'ואו, האקדמיה למדעי החקלאות בגוויג'ואו. יש לבחור את הזרעים השלמים ולשתול אותם באדמה (מצע: אדמה = 3:1), ולאסוף את השורשים, הגבעולים והעלים לאחר שלב ארבעת העלים. הצמחים טופלו ב-20% PEG 6000 כדי לדמות בצורת, והעלים נאספו לאחר 0, 3, 6, 12 ו-24 שעות. כל דגימות הצמחים הוקפאו מיד בחנקן נוזלי ולאחר מכן אוחסנו במקפיא של -80°C לבדיקה הבאה.
כל הנתונים שהתקבלו או נותחו במהלך מחקר זה כלולים במאמר שפורסם ובקבצי המידע המשלימים.