תוספת קוטלי פטריות מפחיתה את רווח האנרגיה נטו ואת גיוון המיקרוביום בדבורי בנאים יחידניות.

תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים תמכה ב-CSS באופן מוגבל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן שלכם (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא עיצוב או JavaScript.
קוטלי פטריות משמשים לעתים קרובות במהלך פריחת פירות העצים ויכולים לאיים על מאביקי חרקים. עם זאת, מעט ידוע על האופן שבו מאביקים שאינם דבורים (למשל, דבורים יחידאיות, אוסמיה קורניפרון) מגיבים לקוטלי פטריות מגע וסיסטמיים המשמשים בדרך כלל על תפוחים במהלך הפריחה. פער ידע זה מגביל החלטות רגולטוריות הקובעות ריכוזים בטוחים ותזמון ריסוס פטריות. הערכנו את ההשפעות של שני קוטלי פטריות מגע (קפטן ומנקוזב) וארבעה קוטלי פטריות בין-שכבתיים/פיטוסיסטמיים (ציפרוציקלין, מיקלובוטניל, פירוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין). השפעות על עלייה במשקל הזחלים, הישרדות, יחס מין ומגוון חיידקים. ההערכה נערכה באמצעות ביו-אסאי פומי כרוני שבו טופלה האבקה בשלוש מנות בהתבסס על המינון המומלץ כיום לשימוש בשטח (1X), חצי מינון (0.5X) ומינון נמוך (0.1X). ​​כל המינונים של מנקוזב ופיריטיסולין הפחיתו משמעותית את משקל הגוף ואת הישרדות הזחלים. לאחר מכן ריצפו את הגן 16S כדי לאפיין את בקטריום הזחל של מנקוזב, קוטל הפטריות האחראי לתמותה הגבוהה ביותר. מצאנו כי מגוון ושפע חיידקים פחתו משמעותית בזחלים שניזונו מאבקנים שטופלו במנקוזב. תוצאות המעבדה שלנו מצביעות על כך שריסוס חלק מקוטלי הפטריות הללו במהלך הפריחה מזיק במיוחד לבריאותם של O. cornifrons. מידע זה רלוונטי להחלטות ניהול עתידיות בנוגע לשימוש בר-קיימא במוצרי הגנה לעצי פרי ומשמש כבסיס לתהליכים רגולטוריים שמטרתם להגן על מאביקים.
דבורת הבנאים הבודדת Osmia cornifrons (Hymenoptera: Megachilidae) הובאה לארצות הברית מיפן בסוף שנות ה-70 ותחילת שנות ה-80, ומאז המין מילא תפקיד חשוב כמאביק במערכות אקולוגיות מנוהלות. אוכלוסיות מתורבתות של דבורה זו הן חלק מכ-50 מינים של דבורי בר המשלימים את הדבורים המאביקות מטעי שקדים ותפוחים בארצות הברית2,3. דבורי הבנאים מתמודדות עם אתגרים רבים, כולל פיצול בתי גידול, פתוגנים וחומרי הדברה3,4. מבין קוטלי החרקים, קוטלי פטריות מפחיתים את צריכת האנרגיה, חיפוש המזון5 ואת כושר הגוף6,7. למרות שמחקרים אחרונים מצביעים על כך שבריאותן של דבורי הבנאים מושפעת ישירות ממיקרואורגניזמים קומנסליים ואקטובקטיים8,9, מכיוון שחיידקים ופטריות יכולים להשפיע על התזונה ותגובות חיסוניות, השפעות החשיפה לקוטלי פטריות על המגוון המיקרוביאלי של דבורי הבנאים רק מתחילות להיחקר.
קוטלי פטריות בעלי השפעות שונות (מגע ומערכתיות) מרוססים במטעים לפני ובמהלך הפריחה לטיפול במחלות כמו גלד תפוחים, ריקבון מר, ריקבון חום וטחב אבקתי10,11. קוטלי פטריות נחשבים בלתי מזיקים למאביקים, ולכן הם מומלצים לגננים במהלך תקופת הפריחה; החשיפה והבליעה של קוטלי פטריות אלה על ידי דבורים ידועות יחסית, שכן הן חלק מתהליך רישום חומרי הדברה על ידי הסוכנות להגנת הסביבה של ארה"ב וסוכנויות רגולטוריות לאומיות רבות אחרות12,13,14. עם זאת, השפעות קוטלי הפטריות על אנשים שאינם דבורים ידועות פחות מכיוון שהן אינן נדרשות במסגרת הסכמי אישור שיווק בארצות הברית15. בנוסף, בדרך כלל אין פרוטוקולים סטנדרטיים לבדיקת דבורים בודדות16,17, ותחזוקת מושבות המספקות דבורים לבדיקה היא מאתגרת18. ניסויים של דבורים מנוהלות שונות נערכים יותר ויותר באירופה ובארה"ב כדי לחקור את השפעות חומרי הדברה על דבורי בר, ​​ופרוטוקולים סטנדרטיים פותחו לאחרונה עבור O. cornifrons19.
דבורים קרניים הן מונוציטים ומשמשות באופן מסחרי בגידולי קרפיונים כתוספת או תחליף לדבורי דבש. דבורים אלו מגיחות בין מרץ לאפריל, כאשר הזכרים המוקדמים מגיחים שלושה עד ארבעה ימים לפני הנקבות. לאחר ההזדווגות, הנקבה אוספת באופן פעיל אבקה וצוף כדי לספק סדרה של תאי דגירה בתוך חלל הקן הצינורי (טבעי או מלאכותי)1,20. הביצים מוטלות על אבקה בתוך התאים; לאחר מכן הנקבה בונה קיר חרס לפני שהיא מכינה את התא הבא. הזחלים בשלב הראשון סגורים בתוך הסיסית וניזונים מנוזלים עובריים. מהשלב השני עד החמישי (קדם-גולם), הזחלים ניזונים מאבקה22. לאחר שאספקת האבקה מתרוקנת לחלוטין, הזחלים יוצרים פקעות, מתגלמים ומגיחים כבוגרים באותו תא דגירה, בדרך כלל בסוף הקיץ20,23. הבוגרים מגיחים באביב שלאחר מכן. הישרדות הבוגרים קשורה לעלייה אנרגטית נטו (עלייה במשקל) המבוססת על צריכת מזון. לפיכך, האיכות התזונתית של האבקה, כמו גם גורמים אחרים כמו מזג אוויר או חשיפה לחומרי הדברה, הם גורמים מכריעים של הישרדות ובריאות24.
קוטלי חרקים וקוטלי פטריות המיושמים לפני הפריחה מסוגלים לנוע בתוך כלי הדם של הצמח בדרגות שונות, החל מהשפעות טרנסלמינריות (למשל, מסוגלות לנוע מהמשטח העליון של העלים לפני השטח התחתון, כמו חלק מקוטלי הפטריות) 25 ועד להשפעות מערכתיות באמת. , שיכולות לחדור לכתר מהשורשים, יכולות להיכנס לצוף של פרחי תפוח 26, שם הן יכולות להרוג את הזחלים הבוגרים O. cornifrons 27. חלק מחומרי ההדברה גם דולפים לאבקה, ומשפיעות על התפתחות זחלי התירס וגורמות למותם 19. מחקרים אחרים הראו שחלק מקוטלי הפטריות יכולים לשנות באופן משמעותי את התנהגות הקינון של המין הקרוב O. lignaria 28. בנוסף, מחקרי מעבדה ושטח המדמים תרחישי חשיפה לחומרי הדברה (כולל קוטלי פטריות) הראו שחומרי הדברה משפיעים לרעה על הפיזיולוגיה 22 המורפולוגיה 29 ועל הישרדותן של דבורי דבש וכמה דבורים יחידניות. ריסוסים שונים של קוטלי פטריות המיושמים ישירות על פרחים פתוחים במהלך הפריחה עלולים לזהם אבקה שנאספה על ידי פרחים בוגרים להתפתחות זחלים, שהשפעותיהן נותרו לחקור 30.
גוברת ההכרה כי התפתחות הזחלים מושפעת מאבקנים ומקהילות מיקרוביאליות במערכת העיכול. המיקרוביום של דבורת הדבש משפיע על פרמטרים כגון מסת גוף31, שינויים מטבוליים22 ורגישות לפתוגנים32. מחקרים קודמים בחנו את השפעת שלב ההתפתחות, חומרי הזנה וסביבה על המיקרוביום של דבורים יחידאיות. מחקרים אלה חשפו קווי דמיון במבנה ובשפע המיקרוביום של הזחל והאבקנים33, כמו גם בסוגי החיידקים הנפוצים ביותר Pseudomonas ו-Delftia, בקרב מיני דבורים יחידאיות. עם זאת, למרות שקוטלי פטריות נקשרו לאסטרטגיות להגנה על בריאות הדבורים, השפעות קוטלי פטריות על המיקרוביוטה של ​​הזחלים באמצעות חשיפה ישירה דרך הפה נותרו בלתי נחקרו.
מחקר זה בחן את ההשפעות של מינונים אמיתיים של שישה קוטלי פטריות נפוצים הרשומים לשימוש על פירות עצים בארצות הברית, כולל קוטלי פטריות מגע וקוטלי פטריות סיסטמיים הניתנים דרך הפה לזחלי עש קרני התירס ממזון מזוהם. מצאנו שקוטלי פטריות מגע וקוטלי פטריות סיסטמיים הפחיתו את העלייה במשקל הגוף של דבורים והגבירו את התמותה, כאשר ההשפעות החמורות ביותר קשורות למנקוזב ופיריתיופיד. לאחר מכן, השווינו את המגוון המיקרוביאלי של זחלים שניזונו מתזונת אבקה שטופלה במנקוזב עם אלו שניזונו מתזונת הביקורת. אנו דנים במנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס התמותה ובהשלכות על תוכניות משולבות לניהול מזיקים ומאביקים (IPPM)36.
פקעות O. cornifrons בוגרות החורף בפקעות התקבלו ממרכז המחקר לפירות, ביגלרוויל, פנסילבניה, ואוחסנו בטמפרטורה של -3 עד 2 מעלות צלזיוס (±0.3 מעלות צלזיוס). לפני הניסוי (600 פקעות בסך הכל). במאי 2022, 100 פקעות O. cornifrons הועברו מדי יום לכוסות פלסטיק (50 פקעות לכוס, קוטר 5 ס"מ × אורך 15 ס"מ) ומגבונים הונחו בתוך הכוסות כדי לקדם פתיחה ולספק מצע לעיסה, מה שמפחית את הלחץ על דבורי האבן37. הניחו שתי כוסות פלסטיק המכילות פקעות בכלוב חרקים (30 × 30 × 30 ס"מ, BugDorm MegaView Science Co. Ltd., טייוואן) עם מתקני האכלה של 10 מ"ל המכילים תמיסת סוכרוז 50% ואחסנו למשך ארבעה ימים כדי להבטיח סגירה והזדווגות. 23 מעלות צלזיוס, לחות יחסית 60%, תקופת אור של 10 ליטר (עוצמה נמוכה): 14 ימים. 100 נקבות וזכרים שהזדווגו שוחררו בכל בוקר במשך שישה ימים (100 ביום) לשני קינים מלאכותיים במהלך שיא פריחת התפוחים (קן מלכודת: רוחב 33.66 × גובה 30.48 × אורך 46.99 ס"מ; איור משלים 1). הקינים הוצבו בארבורטום של מדינת פנסילבניה, ליד דובדבן (Prunus cerasus 'Eubank' Sweet Cherry Pie™), אפרסק (Prunus persica 'Contender'), Prunus persica 'PF 27A' Flamin Fury®), אגס (Pyrus perifolia 'Olympic', Pyrus perifolia 'Shinko', Pyrus perifolia 'Shinseiki'), עץ תפוח קורונריה (Malus coronaria) וזנים רבים של עצי תפוח (Malus coronaria, Malus), עץ תפוח ביתי 'Co-op 30′ Enterprise™, עץ תפוח Malus 'Co-Op 31′ Winecrisp™, ביגוניה 'Freedom', ביגוניה 'Golden Delicious', ביגוניה 'Nova Spy'). כל שובך ציפורים כחול מפלסטיק מתאים לשני קופסאות עץ. כל קופסת קינון הכילה 800 צינורות נייר קראפט ריקים (פתוחים ספירליים, קוטר פנימי של 0.8 ס"מ × אורך של 15 ס"מ) (Jonesville Paper Tube Co., מישיגן) שהוכנסו לתוך צינורות צלופן אטומים (קוטר חיצוני של 0.7 ס"מ, ראה פקקי פלסטיק (פקקי T-1X) מספקים אתרי קינון.
שתי תיבות הקינון פנו מזרחה וכוסו בגדר גינה מפלסטיק ירוק (דגם Everbilt #889250EB12, גודל פתח 5 × 5 ס"מ, 0.95 מ' × 100 מ') כדי למנוע גישה של מכרסמים וציפורים והונחו על פני האדמה ליד תיבות האדמה של תיבת הקינון. תיבת קינון (איור משלים 1א'). ביצי מקדחי התירס נאספו מדי יום על ידי איסוף 30 צינורות מהקינים והובלתם למעבדה. בעזרת מספריים, בצעו חתך בקצה הצינור, ולאחר מכן פירקו את הצינור הספירלי כדי לחשוף את תאי הדגרה. ביצים בודדות ואבקתן הוסרו באמצעות מרית מעוקלת (ערכת כלים Microslide, BioQuip Products Inc., קליפורניה). הביצים הודגרו על נייר סינון לח והונחו בצלחת פטרי למשך שעתיים לפני שהשתמשו בהן בניסויים שלנו (איור משלים 1ב'-ד').
במעבדה, הערכנו את הרעילות דרך הפה של שישה קוטלי פטריות שהוחלו לפני ובמהלך פריחת התפוח בשלושה ריכוזים (0.1X, 0.5X ו-1X, כאשר 1X הוא הכמות המיושמת לכל 100 גלונים של מים/דונם. מינון גבוה בשטח = ריכוז בשטח). , טבלה 1). כל ריכוז חזר על עצמו 16 פעמים (n = 16). שני קוטלי פטריות במגע (טבלה S1: מנקוזב 2696.14 ppm וקפטן 2875.88 ppm) וארבעה קוטלי פטריות סיסטמיים (טבלה S1: פיריתיוסטרובין 250.14 ppm; טריפלוקסיסטרובין 110.06 ppm; מיקלובוטניל אזול 75.12 ppm; ציפרודיניל 280.845 ppm) היו רעילים לפירות, ירקות וגידולי נוי. ביצענו הומוגניות של האבקה באמצעות מטחנה, העברנו 0.20 גרם לבאר (צלחת פלקון בת 24 בארות), והוספנו וערבבנו 1 מיקרוליטר של תמיסת קוטל פטריות ליצירת אבקה פירמידלית עם בארות בעומק 1 מ"מ שאליהם הונחו הביצים. הנחנו את התערובת באמצעות מרית מיניאטורית (איור משלים 1c,d). לוחות פלקון אוחסנו בטמפרטורת החדר (25°C) ולחות יחסית של 70%. השווינו אותן לזחלי ביקורת שניזונו מתזונה הומוגנית של אבקה שטופלה במים טהורים. תיעדנו את התמותה ומדדנו את משקל הזחלים כל יומיים עד שהזחלים הגיעו לגיל טרום-גולם באמצעות משקל אנליטי (Fisher Scientific, דיוק = 0.0001 גרם). לבסוף, יחס המינים הוערך על ידי פתיחת הגולם לאחר 2.5 חודשים.
DNA חולץ מזחלי O. cornifrons שלמים (n = 3 לכל תנאי טיפול, אבקה שטופלה במנקוזב ואבקה שלא טופלה) וביצענו ניתוחי גיוון מיקרוביאלי על דגימות אלו, במיוחד משום שבמנקוזב נצפתה התמותה הגבוהה ביותר בזחלי שקיבלו MnZn. ה-DNA הוגבר, טוהר באמצעות ערכת DNAZymoBIOMICS®-96 MagBead DNA (Zymo Research, Irvine, CA), ורוצף (600 מחזורים) על גבי Illumina® MiSeq™ באמצעות ערכת v3. ריצוף ממוקד של גנים של RNA ריבוזומלי חיידקי 16S בוצע באמצעות ערכת Quick-16S™ NGS Library Prep Kit (Zymo Research, Irvine, CA) תוך שימוש בפריימרים המכוונים לאזור V3-V4 של גן 16S rRNA. בנוסף, ריצוף 18S בוצע באמצעות הכללת PhiX של 10%, והגברה בוצעה באמצעות זוג הפריימרים 18S001 ו-NS4.
ייבוא ​​ועיבוד של קריאות מזווגות39 באמצעות צינור QIIME2 (גרסה 2022.11.1). קריאות אלו נחתכו ואוזגו, ורצפים כימריים הוסרו באמצעות תוסף DADA2 ב-QIIME2 (זיווג רעשים של qiime dada2)40. הקצאות המחלקות 16S ו-18S בוצעו באמצעות תוסף מסווג האובייקטים Classify-sklearn והארטיפקט silva-138-99-nb-classifier שאומן מראש.
כל נתוני הניסוי נבדקו לנורמליות (שפירו-וילקס) והומוגניות השונות (מבחן לוון). מכיוון שמערך הנתונים לא עמד בהנחות של ניתוח פרמטרי והטרנספורמציה לא הצליחה לתקנן את השאריות, ביצענו ניתוח ANOVA דו-כיווני לא פרמטרי (Kruskal-Wallis) עם שני גורמים [זמן (נקודות זמן תלת-פאזיות 2, 5 ו-8 ימים) וקוטל פטריות] כדי להעריך את השפעת הטיפול על משקל טרי של הזחל, לאחר מכן בוצעו השוואות זוגיות לא פרמטריות לאחר מכן באמצעות מבחן ווילקוקסון. השתמשנו במודל ליניארי מוכלל (GLM) עם התפלגות פואסון כדי להשוות את השפעות קוטלי פטריות על ההישרדות על פני שלושה ריכוזי קוטלי פטריות41,42. עבור ניתוח שפע דיפרנציאלי, מספר גרסאות רצף האמפליקון (ASV) צומצם ברמת הסוג. השוואות של שפע דיפרנציאלי בין קבוצות באמצעות 16S (ברמת סוג) ושפע יחסי של 18S בוצעו באמצעות מודל אדיטיבי כללי למיקום, קנה מידה וצורה (GAMLSS) עם התפלגויות משפחתיות BEZI (beta zero-inflated), אשר עוצבו על פי מודל מאקרו במיקרוביום R43 (גרסה 1.1). 1). הסר מיני מיטוכונדריה וכלורופלסט לפני הניתוח הדיפרנציאלי. בגלל הרמות הטקסונומיות השונות של 18S, רק הרמה הנמוכה ביותר של כל טקסון שימשה לניתוחים דיפרנציאליים. כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות R (גרסה 3.4.3., פרויקט CRAN) (צוות 2013).
חשיפה למנקוזב, פיריתיוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין הפחיתה משמעותית את העלייה במשקל הגוף ב-O. cornifrons (איור 1). השפעות אלו נצפו באופן עקבי עבור כל שלושת המינונים שנבדקו (איור 1א'-ג'). ציקלוסטרובין ומיקלובוטניל לא הפחיתו משמעותית את משקל הזחלים.
משקל טרי ממוצע של זחלי קדחי גזע שנמדד בשלוש נקודות זמן תחת ארבעה טיפולים תזונתיים (הזנת אבקה הומוגנית + קוטל פטריות: ביקורת, מינונים 0.1X, 0.5X ו-1X). (א) מינון נמוך (0.1X): נקודת זמן ראשונה (יום 1): χ2: 30.99, DF = 6; P < 0.0001, נקודת זמן שנייה (יום 5): 22.83, DF = 0.0009; בפעם השלישית; נקודה (יום 8): χ2: 28.39, DF = 6; (ב) חצי מינון (0.5X): נקודת זמן ראשונה (יום 1): χ2: 35.67, DF = 6; P < 0.0001, נקודת זמן שנייה (יום ראשון). ): χ2: 15.98, DF = 6; P = 0.0090; נקודת זמן שלישית (יום 8) χ2: 16.47, DF = 6; (ג) אתר או מינון מלא (1X): נקודת זמן ראשונה (יום 1) χ2: 20.64, P = 6; P = 0.0326, נקודת זמן שנייה (יום 5): χ2: 22.83, DF = 6; P = 0.0009; נקודת זמן שלישית (יום 8): χ2: 28.39, DF = 6; ניתוח שונות לא פרמטרי. העמודות מייצגות ממוצע ± סטייה חד-תכליתית של השוואות זוגיות (α = 0.05) (n = 16) *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.001, ***P ≤ 0.0001.
במינון הנמוך ביותר (X0.1), משקל גוף הזחל הופחת ב-60% עם טריפלוקסיסטרובין, 49% עם מנקוזב, 48% עם מיקלובוטניל ו-46% עם פיריתיסטרובין (איור 1א'). כאשר נחשפו לחצי ממינון השדה (X0.5), משקל גופם של זחלי המנקוזב הופחת ב-86%, פיריתיוסטרובין ב-52% וטריפלוקסיסטרובין ב-50% (איור 1ב'). מינון שדה מלא (X1) של מנקוזב הפחית את משקל הזחל ב-82%, פיריתיוסטרובין ב-70% וטריפלוקסיסטרובין, מיקלובוטניל וסנגרד בכ-30% (איור 1ג').
התמותה הייתה הגבוהה ביותר בקרב זחלים שניזונו מאבקנים שטופלו במנקוזב, ואחריהם פיריתיוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין. התמותה עלתה עם עליית המינונים של מנקוזב ופיריטיסולין (איור 2; טבלה 2). עם זאת, תמותת בוררי תירס עלתה רק במעט ככל שריכוזי הטריפלוקסיסטרובין עלו; ציפרודיניל וקפטן לא הגבירו משמעותית את התמותה בהשוואה לטיפולי ביקורת.
תמותת זחלי זבוב הבורר הושוותה לאחר בליעת אבקה שטופלה בנפרד בשישה קוטלי פטריות שונים. מנקוזב ופנטופירמיד היו רגישים יותר לחשיפה דרך הפה לרימות תירס (GLM: χ = 29.45, DF = 20, P = 0.0059) (קו, שיפוע = 0.29, P < 0.001; שיפוע = 0.24, P < 0.00)).
בממוצע, בכל הטיפולים, 39.05% מהמטופלות היו נשים ו-60.95% היו גברים. מבין טיפולי הביקורת, שיעור הנשים היה 40% הן במחקר המינון הנמוך (0.1X) והן במחקר חצי המינון (0.5X), ו-30% במחקרי מינון השדה (1X). במינון של 0.1X, בקרב זחלים שניזונו מאבקנים שטופלו במנקוזב ומיקלובוטניל, 33.33% מהבוגרים היו נקבות, 22% מהבוגרים היו נקבות, 44% מהזחלים הבוגרים היו נקבות, 44% מהזחלים הבוגרים היו נקבות, 41% מהזחלים הבוגרים היו נקבות, ו-31% בקבוצת הביקורת (איור 3א). במינון פי 0.5 מהמינון, 33% מהתולעים הבוגרות בקבוצת המנקוזב והפיריתיוסטרובין היו נקבות, 36% בקבוצת הטריפלוקסיסטרובין, 41% בקבוצת המיקלובוטניל ו-46% בקבוצת הציפרוסטרובין. נתון זה היה 53% בקבוצת הקפטן ו-38% בקבוצת הביקורת (איור 3ב'). במינון פי 1, 30% מקבוצת המנקוזב היו נשים, 36% מקבוצת הפיריתוסטרובין, 44% מקבוצת הטריפלוקסיסטרובין, 38% מקבוצת המיקלובוטניל, 50% מקבוצת הביקורת היו נשים – 38.5% (איור 3ג').
אחוז נקבות וזכרים של נקבות ונקבות לאחר חשיפה לפטריות בשלב הזחל. (א) מינון נמוך (0.1X). ​​(ב) חצי מינון (0.5X). (ג) מינון שדה או מינון מלא (1X).
ניתוח רצף 16S הראה כי קבוצת החיידקים הייתה שונה בין זחלים שניזונו מאבקנים שטופלו במנקוזב לבין זחלים שניזונו מאבקנים לא מטופלים (איור 4א'). מדד המיקרוביאלים של זחלים לא מטופלים שניזונו מאבקנים היה גבוה יותר מזה של זחלים שניזונו מאבקנים שטופלו במנקוזב (איור 4ב'). למרות שההבדל שנצפה בעושר בין הקבוצות לא היה מובהק סטטיסטית, הוא היה נמוך משמעותית מזה שנצפה עבור זחלים שניזונו מאבקנים לא מטופלים (איור 4ג'). שפע יחסי הראה כי המיקרוביוטה של ​​זחלים שניזונו מאבקנים של קבוצת הביקורת הייתה מגוונת יותר מזו של זחלים שניזונו מזחלים שטופלו במנקוזב (איור 5א'). ניתוח תיאורי גילה את נוכחותם של 28 סוגים בדגימות בקרה ובדגימות שטופלו במנקוזב (איור 5ב'). ג' ניתוח באמצעות ריצוף 18S לא גילה הבדלים משמעותיים (איור משלים 2).
פרופילי SAV המבוססים על רצפי 16S הושוו לעושר של שאנון ולעושר שנצפה ברמת המערכה. (א) ניתוח קואורדינטות עיקריות (PCoA) המבוסס על מבנה הקהילה המיקרוביאלית הכולל בזחלים שניזונו מאבקנים או מקבוצת בקרה (כחול) וזחלים שניזונו ממנקוזב (כתום). כל נקודת נתונים מייצגת דגימה נפרדת. PCoA חושב באמצעות מרחק Bray-Curtis של התפלגות t רב-משתנית. האליפסות מייצגות את רמת הביטחון של 80%. (ב) תרשים תיבות, נתוני עושר גולמיים של שאנון (נקודות) ו-g. עושר ניתן לצפייה. תרשים התיבות מציג תיבות עבור קו חציון, טווח בין-רבעוני (IQR) ו-1.5 × IQR (n = 3).
הרכב קהילות מיקרוביאליות של זחלים שניזונו מאבקה שטופלה ואבקה שלא טופלה במנקוזב. (א) שפע יחסי של סוגים מיקרוביאליים בזחלים. (ב) מפת חום של קהילות מיקרוביאליות שזוהו. דלפטיה (יחס סיכויים (OR) = 0.67, P = 0.0030) ופסאודומונס (OR = 0.3, P = 0.0074), מיקרובקטריום (OR = 0.75, P = 0.0617) (OR = 1.5, P = 0.0060); שורות מפת החום מקובצות באמצעות מרחק קורלציה וקישוריות ממוצעת.
תוצאותינו מראות כי חשיפה פומית לקוטלי פטריות במגע (מנקוזב) וסיסטמיים (פירוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין), אשר יושמו באופן נרחב במהלך הפריחה, הפחיתה משמעותית את העלייה במשקל והגדילה את התמותה של זחלי התירס. בנוסף, מנקוזב הפחית משמעותית את הגיוון והעושר של המיקרוביום בשלב טרום-הגולם. מיקלובוטניל, קוטל פטריות סיסטמי נוסף, הפחית משמעותית את העלייה במשקל גוף הזחלים בכל שלוש המנות. השפעה זו הייתה ניכרת בנקודות הזמן השנייה (יום 5) והשלישית (יום 8). לעומת זאת, ציפרודיניל וקפטן לא הפחיתו משמעותית את העלייה במשקל או את ההישרדות בהשוואה לקבוצת הביקורת. למיטב ידיעתנו, עבודה זו היא הראשונה שקובעת את השפעות קצב השימוש בקוטלי פטריות שונים בשטח המשמשים להגנה על גידולי תירס באמצעות חשיפה ישירה לאבקנים.
כל טיפולי קוטלי הפטריות הפחיתו משמעותית את העלייה במשקל הגוף בהשוואה לטיפולי בקרה. למנקוזב הייתה ההשפעה הגדולה ביותר על עלייה במשקל הגוף של הזחלים עם ירידה ממוצעת של 51%, ואחריו פיריתיוסטרובין. עם זאת, מחקרים אחרים לא דיווחו על השפעות שליליות של מינונים של קוטלי פטריות בשטח על שלבי הזחל44. למרות שנוכח כי לביוצידים דיתיוקרבמט יש רעילות חריפה נמוכה45, אתילן ביסדיתיוקרבמטים (EBDCS) כמו מנקוזב יכולים להתפרק לאתילן סולפיד של אוריאה. בהתחשב בהשפעותיו המוטגניות בבעלי חיים אחרים, תוצר פירוק זה עשוי להיות אחראי להשפעות שנצפו46,47. מחקרים קודמים הראו כי היווצרות אתילן תיאוריאה מושפעת מגורמים כגון טמפרטורה גבוהה48, רמות לחות49 ומשך אחסון המוצר50. תנאי אחסון נאותים לביוצידים יכולים למתן תופעות לוואי אלו. בנוסף, רשות בטיחות המזון האירופית הביעה דאגה לגבי רעילותו של פיריתיופיד, שהוכח כמסרטן למערכות העיכול של בעלי חיים אחרים51.
מתן פומי של מנקוזב, פיריתיוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין מגביר את התמותה של זחלי מקדחי התירס. לעומת זאת, למיקלובוטניל, ציפרוציקלין וקפטן לא הייתה השפעה על התמותה. תוצאות אלו שונות מאלה של לדורנר ועמיתיו52, שהראו שקפטן הפחית משמעותית את הישרדותם של O. lignaria ו-Apis mellifera L. בוגרים (Hymenoptera, Apisidae). בנוסף, נמצא כי קוטלי פטריות כמו קפטן ובוסקליד גורמים לתמותת זחלים52,53,54 או משנים את התנהגות האכילה55. שינויים אלו, בתורם, יכולים להשפיע על האיכות התזונתית של האבקה ובסופו של דבר על רווח האנרגיה בשלב הזחל. התמותה שנצפתה בקבוצת הביקורת הייתה עקבית עם מחקרים אחרים56,57.
יחס המינים המועדף על הזכרים שנצפה בעבודתנו עשוי להיות מוסבר על ידי גורמים כגון הזדווגות לא מספקת ותנאי מזג אוויר ירודים במהלך הפריחה, כפי שהוצע בעבר עבור O. cornuta על ידי Vicens ו-Bosch. למרות שלנקבות ולזכרים במחקר שלנו היו ארבעה ימים להזדווג (תקופה הנחשבת בדרך כלל מספקת להזדווגות מוצלחת), הפחתנו במכוון את עוצמת האור כדי למזער את הלחץ. עם זאת, שינוי זה עלול להפריע שלא במתכוון לתהליך ההזדווגות61. בנוסף, דבורים חוות מספר ימים של מזג אוויר גרוע, כולל גשם וטמפרטורות נמוכות (<5°C), אשר יכולים גם הם להשפיע לרעה על הצלחת ההזדווגות4,23.
למרות שהמחקר שלנו התמקד במיקרוביום הזחלים כולו, תוצאותינו מספקות תובנות לגבי קשרים פוטנציאליים בין קהילות חיידקים שעשויים להיות קריטיים לתזונת דבורים ולחשיפה לקוטלי פטריות. לדוגמה, זחלים שניזונו מאבקה שטופלה במנקוזב הראו ירידה משמעותית במבנה ובשפע של קהילות מיקרוביאליות בהשוואה לזחלים שניזונו מאבקה לא מטופלת. בזחלים שצרכו אבקה לא מטופלת, קבוצות החיידקים Proteobacteria ו-Actinobacteria היו דומיננטיות והיו בעיקר אירוביות או אירוביות פקולטטיביות. ידוע שחיידקי דלפט, הקשורים בדרך כלל למיני דבורים יחידאיות, הם בעלי פעילות אנטיביוטית, דבר המצביע על תפקיד מגן פוטנציאלי כנגד פתוגנים. מין חיידקי נוסף, Pseudomonas, היה שופע בזחלים שניזונו מאבקה לא מטופלת, אך היה מופחת משמעותית בזחלים שטופלו במנקוזב. תוצאותינו תומכות במחקרים קודמים שזיהו את Pseudomonas כאחד הסוגים הנפוצים ביותר ב-O. bicornis35 ובצרעות יחידאיות אחרות34. למרות שלא נחקרו ראיות ניסיוניות לתפקידו של Pseudomonas בבריאותם של O. cornifrons, חיידק זה הוכח כמקדם סינתזה של רעלים מגנים בחיפושית Paederus fuscipes ומקדם מטבוליזם של ארגינין במבחנה 35, 65. תצפיות אלו מצביעות על תפקיד פוטנציאלי בהגנה ויראלית וחיידקית במהלך זמן ההתפתחות של זחלי O. cornifrons. Microbacterium הוא סוג נוסף שזוהה במחקר שלנו, אשר דווח כי קיים במספרים גבוהים בזחלי זבוב החייל השחור בתנאי רעב 66. בזחלי O. cornifrons, מיקרובקטריה עשויה לתרום לאיזון ולחוסן של המיקרוביום במעיים בתנאי עקה. בנוסף, Rhodococcus נמצא בזחלי O. cornifrons והוא ידוע ביכולות ניקוי הרעלים שלו 67. סוג זה נמצא גם במעיים של A. florea, אך בשפע נמוך מאוד 68. תוצאותינו מדגימות את נוכחותם של וריאציות גנטיות מרובות על פני טקסונים מיקרוביאליים רבים שיכולים לשנות תהליכים מטבוליים בזחלים. עם זאת, נדרשת הבנה טובה יותר של הגיוון התפקודי של O. cornifrons.
לסיכום, התוצאות מצביעות על כך שמנקוזב, פיריתיוסטרובין וטריפלוקסיסטרובין הפחיתו את העלייה במשקל הגוף והגדילו את התמותה של זחלי מקדחי התירס. למרות שקיימת דאגה גוברת לגבי השפעות קוטלי פטריות על מאביקים, קיים צורך להבין טוב יותר את השפעות המטבוליטים השיוריים של תרכובות אלו. ניתן לשלב תוצאות אלו בהמלצות לתוכניות משולבות לניהול מאביקים המסייעות לחקלאים להימנע משימוש בקוטלי פטריות מסוימים לפני ובמהלך פריחת עצי הפרי על ידי בחירת קוטלי פטריות ושינוי עיתוי היישום, או על ידי עידוד השימוש בחלופות פחות מזיקות 36. מידע זה חשוב לפיתוח המלצות בנוגע לשימוש בחומרי הדברה, כגון התאמת תוכניות ריסוס קיימות ושינוי עיתוי ריסוס בעת בחירת קוטלי פטריות או קידום השימוש בחלופות פחות מסוכנות. יש צורך במחקר נוסף על ההשפעות השליליות של קוטלי פטריות על יחס המינים, התנהגות האכלה, המיקרוביום במעיים והמנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס ירידה במשקל ותמותה של זחלי מקדחי התירס.
נתוני המקור 1, 2 ו-3 באיורים 1 ו-2 הופקדו במאגר הנתונים של figshare DOI: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996245 ו- https://doi.org/10.6084/m9.figshare.24996233. הרצפים שנותחו במחקר הנוכחי (איורים 4, 5) זמינים במאגר NCBI SRA תחת מספר גישה PRJNA1023565.
בוש, ג'. וקמפ, ו.פ. פיתוח וביסוס מיני דבורי דבש כמאביקים של גידולים חקלאיים: הדוגמה של הסוג אוסמיה (Hymenoptera: Megachilidae) ועצי פרי. בול. נטומור. משאב. 92, 3–16 (2002).
פארקר, MG ואחרים. שיטות האבקה ותפיסות של מאביקים חלופיים בקרב מגדלי תפוחים בניו יורק ובפנסילבניה. עדכון. חקלאות. מערכות מזון. 35, 1–14 (2020).
קוך א., לונסדורף א.וו., ארץ ד.ר., פיטס-זינגר ט.ל. וריקיטס ת.ה. אקולוגיה וכלכלה של האבקת שקדים באמצעות דבורים מקומיות. J. Economics. Ntomore. 111, 16–25 (2018).
לי, א., הוא, י., ופארק, י.-ל. השפעות שינויי האקלים על הפנולוגיה של הטרגופן: השלכות על ניהול האוכלוסייה. Climb. Change 150, 305–317 (2018).
Artz, DR and Pitts-Singer, TL השפעת ריסוסים עם קוטלי פטריות ואדג'ובנטים על התנהגות הקינון של שתי דבורים יחידאיות מנוהלות (Osmia lignaria ו-Megachile rotundata). PloS One 10, e0135688 (2015).
Beauvais, S. et al. קוטל פטריות גידולים דל רעילות (פנבוקונאזול) מפריע לאותות איכות הרבייה של הזכרים וכתוצאה מכך מופחת הצלחת ההזדווגות בדבורים בודדות בטבע. J. Apps. ecology. 59, 1596–1607 (2022).
סגולאסטרה פ. ואחרים. קוטלי חרקים ניאוניקוטינואידים וביוסינתזה של ארגוסטרול מדכאים תמותה סינרגטית מקוטלי פטריות בשלושה מיני דבורים. הדברת מזיקים. המדע. 73, 1236–1243 (2017).
Kuhneman JG, Gillung J, Van Dyck MT, Fordyce RF. and Danforth BN זחלי צרעות בודדות משנים את המגוון החיידקי המסופק על ידי אבקה לדבורים המקננות בגבעול Osmia cornifrons (Megachilidae). front. microorganism. 13, 1057626 (2023).
Dharampal PS, Danforth BN and Steffan SA המיקרואורגניזמים האקטוסימביוטיים באבקה מותססת חשובים להתפתחותן של דבורים יחידאיות לא פחות מהאבקה עצמה. אקולוגיה. אבולוציה. 12. e8788 (2022).
קלדרר מ', מאניצ'י ל.מ', קאפוטו פ' ות'להיימר מ'. שתילה בין שורות במטעי תפוחים לשליטה במחלות זריעה חוזרת: מחקר יעילות מעשי המבוסס על אינדיקטורים מיקרוביאליים. Plant Soil 357, 381–393 (2012).
מרטין פל., קרבצ'יק ט., חודדאדי פ., אחימוביץ' ס.ג. ופיטר ק.א. ריקבון מר של תפוחים בארצות הברית במרכז האוקיינוס ​​האטלנטי: הערכת מינים גורמים והשפעת תנאי מזג אוויר אזוריים ורגישות זנים. פיטופולוגיה 111, 966–981 (2021).
Cullen MG, Thompson LJ, Carolan JK, Stout JK. and Stanley DA קוטלי פטריות, קוטלי עשבים ודבורים: סקירה שיטתית של מחקרים ושיטות קיימים. PLoS One 14, e0225743 (2019).
פילינג, א.ד. וג'פסון, פ.סי. השפעות סינרגטיות של קוטלי פטריות EBI וקוטלי חרקים פירתרואידים על דבורי דבש (Apis mellifera). מזיקים למדע. 39, 293–297 (1993).
מוסן, EC, לופז, JE ופנג, CY השפעת קוטלי פטריות נבחרים על גדילה והתפתחות של זחלי דבורי הדבש Apis mellifera L. (Hymenoptera: Apidae). יום רביעי. Ntomore. 33, 1151-1154 (2004).
ואן דייק, מ., מולן, א., ויקסטד, ד., ומקארט, ס. מדריך לקבלת החלטות לשימוש בחומרי הדברה להגנה על מאביקים במטעי עצים (אוניברסיטת קורנל, 2018).
Iwasaki, JM and Hogendoorn, K. חשיפת דבורים לחומרים שאינם חומרי הדברה: סקירת שיטות ותוצאות מדווחות. חקלאות. אקוסיסטם. יום רביעי. 314, 107423 (2021).
Kopit AM, Klinger E, Cox-Foster DL, Ramirez RA. and Pitts-Singer TL השפעת סוג האספקה ​​וחשיפה לחומרי הדברה על התפתחות הזחלים של Osmia lignaria (Hymenoptera: Megachilidae). Wednesday. Ntomore. 51, 240–251 (2022).
קופיט AM ופיטס-זינגר TL מסלולי חשיפה לחומרי הדברה לדבורים יחידניות בעלות קן ריק. יום רביעי. נטומור. 47, 499–510 (2018).
פאן, נ.ט. ואחרים. פרוטוקול ביו-אסאי חדש לבליעה להערכת רעילות חומרי הדברה בדבורי גינה יפניות בוגרות (אוסמיה קורניפרונים). המדע. דוחות 10, 9517 (2020).