הערכה של יוד ואברמקטין כגורמים למחלת נמטודות של אורן

נמטודה האורן היא אנדופריט נודד בהסגר הידוע כגורם להפסדים כלכליים חמורים במערכות אקולוגיות של יערות אורנים. המחקר הנוכחי סוקר את הפעילות הנמטית של אינדולים הלוגנים כנגד נמטודות אורן ומנגנון הפעולה שלהם. הפעילויות הנמטיות של 5-iodoindole ושל avermectin (בקרה חיובית) נגד נמטודות אורן היו דומות וגבוהות בריכוזים נמוכים (10 מיקרוגרם/מ"ל). 5-iodoindole הפחית את הפוריות, פעילות הרבייה, תמותה עוברית וזחל, והתנהגות תנועתית. אינטראקציות מולקולריות של ליגנדים עם קולטנים של תעלות כלוריד תלויות גלוטמט הספציפיות לחסרי חוליות תומכות ברעיון ש-5-iodoindole, כמו avermectin, נקשר בחוזקה לאתר הפעיל של הקולטן. 5-Iodoindole גם גרמה לעיוותים פנוטיפיים שונים בנמטודות, כולל קריסה/התכווצות איברים לא נורמליים ו-vacuolization מוגבר. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-vacuoles עשויות למלא תפקיד במוות מתווך מתילציה של נמטודות. חשוב לציין, 5-iodoindole לא היה רעיל לשני מיני הצמחים (כרוב וצנון). לפיכך, מחקר זה מדגים שיישום יודואינדול בתנאי סביבה יכול לשלוט בפגיעה בנבלת אורן.
נמטודה עץ אורן (Bursaphelenchus xylophilus) שייכת לנמטודות עץ אורן (PWN), נמטודות אנדופרזיות נודדות הידוע כגורם נזק אקולוגי חמור למערכות אקולוגיות של יערות האורנים1. מחלת נמיית אורן (PWD) הנגרמת על ידי נמטודה עץ האורן הופכת לבעיה רצינית במספר יבשות, כולל אסיה ואירופה, ובצפון אמריקה, הנמטודה משמידה מיני אורן שהוכנסו. ירידת עצי האורן היא בעיה כלכלית גדולה, והסיכוי להתפשטות הגלובלית שלו מדאיג3. מיני האורנים הבאים מותקפים לרוב על ידי הנמטודה: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii ו-Pinus radiata4. נמטודה אורן היא מחלה חמורה שיכולה להרוג עצי אורן תוך שבועות או חודשים מההדבקה. בנוסף, התפרצויות נמטודות אורן שכיחות במגוון מערכות אקולוגיות, ולכן נוצרו שרשרות זיהום מתמשכות1.
Bursaphelenchus xylophilus היא נמטודה צמח-טפילית בהסגר השייכת למשפחת העל Aphelenchoidea ו-Clade 102.5. הנמטודה ניזונה מפטריות ומתרבה ברקמות העץ של עצי אורן, ומתפתחת לארבעה שלבי זחל שונים: L1, L2, L3, L4 ואדם בוגר1,6. בתנאים של מחסור במזון, נמטודה האורן עוברת לשלב זחל מיוחד - dauer, המטפיל את הווקטור שלו - חיפושית קליפת האורן (Monochamus alternatus) ומועברת לעצי אורן בריאים. במארחים בריאים, נמטודות נודדות במהירות דרך רקמות צמחיות וניזונות מתאי פרנכימאטיים, מה שמוביל למספר תגובות רגישות יתר, נבילת אורן ומוות תוך שנה לאחר ההדבקה1,7,8.
הדברה ביולוגית של נמטודות אורן היא כבר מזמן אתגר, עם אמצעי הסגר החל מהמאה ה-20. אסטרטגיות נוכחיות לשליטה בנמטודות אורן כוללות בעיקר טיפולים כימיים, כולל חיטוי עצים והשתלה של קוטלי נמטיות לתוך גזעי עצים. הקוטלים הנמטיים הנפוצים ביותר הם אוורמקטין ואברמקטין בנזואט, השייכים למשפחת האברמקטינים. כימיקלים יקרים אלה יעילים מאוד נגד מיני נמטודות רבים ונחשבים בטוחים לסביבה9. עם זאת, שימוש חוזר בחומרים נמטיים אלו צפוי ליצור לחץ סלקציה שיוביל כמעט בוודאות להופעת נמטודות אורן עמידות, כפי שהוכח עבור מספר מזיקים של חרקים, כגון Leptinotarsa ​​decemlineata, Plutella xylostella והנמטודות Trichostrongylus colubriformis ו-Ostertagia circa, אשר פיתחו עמידות ל- Gradumcinacta circa. avermectins10,11,12. לכן, יש לחקור באופן קבוע דפוסי התנגדות ולבצע בדיקה מתמשכת של קוטלי נמטיציות כדי למצוא אמצעים חלופיים, חסכוניים וידידותיים לסביבה לשליטה ב-PVD. בעשורים האחרונים, מספר מחברים הציעו שימוש בתמציות צמחים, שמנים אתריים וחומרים נדיפים כחומרי שליטה בנמטודות13,14,15,16.
לאחרונה הדגמנו את הפעילות הנמטית של אינדול, מולקולת איתות בין-תאית ובין ממלכתית, ב-Caenorhabditis elegans 17. אינדול הוא אות תוך-תאי נפוץ באקולוגיה מיקרוביאלית, השולט בתפקודים רבים המשפיעים על הפיזיולוגיה המיקרוביאלית, היווצרות נבגים, יציבות פלסמיד, עמידות לתרופות, היווצרות ביופילם וארסיות 18, 19. הפעילות של אינדול ונגזרותיו נגד נמטודות פתוגניות אחרות לא נחקרה. במחקר זה, חקרנו את הפעילות הנמטית של 34 אינדולים נגד נמטודות אורן והבהרנו את מנגנון הפעולה של ה-5-iodoindole החזק ביותר באמצעות מיקרוסקופיה, צילום זמן-lapse וניסויי עגינה מולקולרית, והערכנו את ההשפעות הרעילות שלו על צמחים באמצעות מבחן נביטת זרעים.
ריכוזים גבוהים (מעל 1.0 מ"מ) של אינדול דווחו בעבר כבעלי השפעה נמטית על נמטודות17. לאחר טיפול ב-B. xylophilus (שלבי חיים מעורבים) עם אינדול או 33 נגזרות אינדול שונות ב-1 mM, נמדדה תמותה של B. xylophilus על ידי ספירת נמטודות חיות ומתות בקבוצת הביקורת והמטופלים. חמישה אינדולים הפגינו פעילות נמטית משמעותית; ההישרדות של קבוצת הביקורת שלא טופלה הייתה 95 ± 7% לאחר 24 שעות. מתוך 34 האינדולים שנבדקו, 5-iodoindole ו-4-fluoroindole ב-1 mM גרמו לתמותה של 100%, בעוד ש-5,6-difluoroindigo, methylindol-7-carboxylate ו-7-iodoindol גרמו לתמותה של כ-50% (טבלה 1).
השפעת 5-iodoindole על היווצרות ואקואול ומטבוליזם של נמטודה של עץ אורן. (א) השפעת avermectin ו-5-iodoindole על נמטודות זכר בוגרות, (B) ביצי נמטודה בשלב L1 ו-(C) מטבוליזם של B. xylophilus, (i) vacuoles לא נצפו ב-0 h, הטיפול הביא (ii) vacuoles, (iii) הצטברות של vacuoles מרובות, (v) fusion of vacuoles, (v) fusion of vacuoles vacuoles ו (vi) היווצרות של vacuoles ענקיים. חיצים אדומים מצביעים על התנפחות של ואקוולים, חיצים כחולים מציינים היתוך של ואקוולים וחצים שחורים מציינים ואקוולים ענקיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
בנוסף, מחקר זה תיאר גם את התהליך הרציף של מוות המושרה מתאן בנמטודות אורן (איור 4C). מוות מתנוגני הוא סוג לא אפופטוטי של מוות תאים הקשור להצטברות של ואקוולים ציטופלזמיים בולטים27. נראה שהפגמים המורפולוגיים שנצפו בנמטודות אורן קשורות קשר הדוק למנגנון המוות המושרה על ידי מתאן. בדיקה מיקרוסקופית בזמנים שונים הראתה ש-vacuoles ענקיים נוצרו לאחר 20 שעות של חשיפה ל-5-iodoindole (0.1 mM). ואקואולים מיקרוסקופיים נצפו לאחר 8 שעות של טיפול, ומספרם עלה לאחר 12 שעות. נצפו מספר ואקוולים גדולים לאחר 14 שעות. כמה ואקוולים התמזגו נראו בבירור לאחר 12-16 שעות של טיפול, מה שמצביע על כך שהיתוך ואקואול הוא הבסיס למנגנון המוות המתנוגני. לאחר 20 שעות, נמצאו כמה ואקואולים ענקיים ברחבי התולעת. תצפיות אלו מייצגות את הדיווח הראשון על מטואוזיס ב-C. elegans.
בתולעים שטופלו ב-5-iodoindole, נצפו גם הצטברות וקרע של וואקואולים (איור 5), כפי שמעידים כיפוף תולעים ושחרור ואקואול לסביבה. הפרעה ב-vacuole נצפתה גם בקרום קליפת הביצה, שבדרך כלל נשמר שלם על ידי L2 במהלך הבקיעה (איור משלים. S2). תצפיות אלו תומכות במעורבות של הצטברות נוזלים וכישלון אוסמו-וויסות, כמו גם פגיעה בתאים הפיכים (RCI), בתהליך של היווצרות ואקואול (איור 5).
בהשערת תפקידו של יוד בהיווצרות הוואקואול שנצפה, חקרנו את הפעילות הנמטית של יודיד נתרן (NaI) ואשלגן יודיד (KI). עם זאת, בריכוזים (0.1, 0.5 או 1 מ"מ), הם לא השפיעו על הישרדות נמטודות או על היווצרות ואקואול (איור משלים. S5), אם כי ל-1 מ"מ KI הייתה השפעה נמטית קלה. מצד שני, 7-iodoindole (1 או 2 mM), כמו 5-iodoindole, גרמו ל-vacuole מרובים ועיוותים מבניים (איור משלים. S6). שני היודואינדולים הראו מאפיינים פנוטיפיים דומים בנמטודות אורן, בעוד NaI ו-KI לא. באופן מעניין, אינדול לא גרם להיווצרות וואקואול ב-B. xylophilus בריכוזים שנבדקו (לא מוצגים נתונים). לפיכך, התוצאות אישרו כי קומפלקס אינדול-יוד אחראי על ואקווליזציה ומטבוליזם של B. xylophilus.
מבין האינדולים שנבדקו לפעילות נמטית, ל-5-iodoindole היה אינדקס החלקה הגבוה ביותר של -5.89 קק"ל/מול, ואחריו 7-iodoindole (-4.48 קק"ל/מול), 4-fluoroindole (-4.33) ואינדול (-4.03) (איור 6). עמוד השדרה החזק של קשר מימן של 5-iodoindole לאוצין 218 מייצב את הקישור שלו, בעוד שכל שאר נגזרות האינדול נקשרות לסרין 260 באמצעות קשרי מימן צדדיים. בין שאר היודואינדולים בדגם, ל-2-iodoindole יש ערך מקשר של -5.248 קק"ל/מול, אשר נובע מקשר המימן העיקרי שלו עם לאוצין 218. קישורים ידועים אחרים כוללים 3-iodoindole (-4.3 קק"ל/מול), 4-iodoindole (-4.0 קק"ל/מול) ו-6-6מולרי עליון (S-2. איור S8). רוב האינדולים ההלוגניים והאינדול עצמו, למעט 5-iodoindole ו-2-iodoindole, יוצרים קשר עם סרין 260. העובדה שקשור מימן עם לאוצין 218 מעיד על קישור יעיל של קולטן-ליגנד, כפי שנצפתה עבור איברמקטין (איור משלים. S7-io), מאשרת שקישור מימן עם לאוצין 218. ivermectin, נקשרים בחוזקה לאתר הפעיל של קולטן GluCL באמצעות לאוצין 218 (איור 6 ואיור משלים. S8). אנו מציעים שקישור זה נדרש כדי לשמור על מבנה הנקבוביות הפתוחות של קומפלקס GluCL וכי על ידי קישור הדוק לאתר הפעיל של קולטן GluCL, 5-iodoindole, 2-iodoindole, avermectin ואיvermectin ובכך לשמור על תעלת היונים פתוחה ולאפשר ספיגת נוזלים.
עגינה מולקולרית של אינדול ואינדול הלוגני ל-GluCL. כיווני קישור של (A) אינדול, (B) 4-fluoroindole, (C) 7-iodoindole, ו-(D) 5-iodoindole ligands לאתר הפעיל של GluCL. החלבון מיוצג על ידי סרט, וקשרי מימן בעמוד השדרה מוצגים כקווים מקווקו צהובים. (A′), (B′), (C′) ו-(D′) מציגים את האינטראקציות של הליגנדים המתאימים עם שיירי חומצות האמינו שמסביב, וקשרי המימן הצדדיים מסומנים בחצים מנוקדים ורודים.
ניסויים נערכו כדי להעריך את ההשפעה הרעילה של 5-iodoindole על הנביטה של ​​זרעי כרוב וצנון. ל-5-iodoindole (0.05 או 0.1 mM) או avermectin (10 מיקרוגרם/מ"ל) הייתה השפעה מועטה או לא על הנביטה הראשונית ועל הופעת הצמח (איור 7). בנוסף, לא נמצא הבדל מובהק בין קצב הנביטה של ​​ביקורת לא מטופלת לבין זרעים שטופלו ב-5-iodoindole או avermectin. ההשפעה על התארכות השורשים ומספר השורשים הצדדיים שנוצרו לא הייתה משמעותית, אם כי 1 mM (פי 10 הריכוז הפעיל שלו) של 5-iodoindole עיכב מעט את התפתחות השורשים הצדדיים. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-5-iodoindole אינו רעיל לתאי צמחים ואינו מפריע לתהליכי התפתחות הצמחים בריכוזים שנחקרו.
השפעת 5-iodoindole על נביטת זרעים. נביטה, הנבטה והשרשה לרוחב של זרעי B. oleracea ו-R. raphanistrum על מדיום Murashige ו-Skoog אגר עם או בלי avermectin או 5-iodoindole. הנביטה נרשמה לאחר 3 ימי דגירה ב-22 מעלות צלזיוס.
מחקר זה מדווח על מספר מקרים של הרג נמטודות על ידי אינדולים. חשוב לציין, זהו הדיווח הראשון של מתילציה הגורמת ליודואינדול (תהליך הנגרם מהצטברות של ואקואולים קטנים שמתמזגים בהדרגה ל-vacuoles ענקיים, מה שמוביל בסופו של דבר לקרע קרום ומוות) במחטי אורן, כאשר יודואינדול מציג תכונות קוטל נמטיות משמעותיות הדומות לאלו של ה-nematicide המסחרי.
בעבר דווח כי אינדולים מפעילים פונקציות איתות מרובות בפרוקריוטים ובאוקריוטים, כולל עיכוב/היווצרות ביופילם, הישרדות חיידקים ופתוגניות19,32,33,34. לאחרונה, ההשפעות הטיפוליות הפוטנציאליות של אינדולים הלוגנים, אלקלואידים אינדולים ונגזרות אינדול חצי סינתטיות משכו עניין מחקרי נרחב35,36,37. לדוגמה, הוכח כי אינדולים הלוגנים הורגים תאי Escherichia coli ו- Staphylococcus aureus מתמשכים37. בנוסף, יש עניין מדעי לחקור את היעילות של אינדולים הלוגניים כנגד מינים, סוגים וממלכות אחרים, ומחקר זה הוא צעד לקראת השגת מטרה זו.
כאן, אנו מציעים מנגנון לקטלניות המושרה על ידי 5-iodoindole ב-C. elegans המבוסס על פגיעה בתאים הפיכים (RCI) ומתילציה (איורים 4C ו-5). שינויים בצקתיים כגון נפיחות וניוון ואקואולרי הם אינדיקטורים ל-RCI ומתילציה, המתבטאים כוואקוולים ענקיים בציטופלזמה48,49. RCI מפריע לייצור אנרגיה על ידי הפחתת ייצור ATP, גורם לכשל במשאבת ATPase, או שיבוש קרומי התא וגרימת זרימה מהירה של Na+, Ca2+ ומים50,51,52. ואקוולים תוך-ציטופלסמיים נוצרים בתאי בעלי חיים כתוצאה מהצטברות נוזלים בציטופלזמה עקב נהירה של Ca2+ ומים53. מעניין שמנגנון זה של נזק לתאים הוא הפיך אם הנזק הוא זמני והתאים מתחילים לייצר ATP לפרק זמן מסוים, אך אם הנזק נמשך או מחמיר, התאים מתים.54 התצפיות שלנו מראות שנמטודות שטופלו ב-5-iodoindole אינן מסוגלות לשחזר ביו-סינתזה תקינה לאחר חשיפה לתנאי לחץ.
פנוטיפ המתילציה המושרה על ידי 5-iodoindole ב-B. xylophilus עשוי לנבוע מנוכחות של יוד והפצה מולקולרית שלו, שכן ל-7-iodoindole הייתה השפעה מעכבת פחות על B. xylophilus מאשר ל-5-iodoindole (טבלה 1 ואיור משלים S6). תוצאות אלו תואמות חלקית למחקרים של Maltese et al. (2014), אשר דיווחו כי טרנסלוקציה של חלקת החנקן פירידיל באינדול מ-para- ל-meta-position ביטלה ואקווליזציה, עיכוב צמיחה וציטוטוקסיות בתאי U251, מה שמצביע על כך שהאינטראקציה של המולקולה עם אתר פעיל ספציפי בחלבון היא קריטית27,44,45. האינטראקציות בין אינדולים או אינדולים הלוגנים לקולטני GluCL שנצפו במחקר זה תומכות אף הן בתפיסה זו, שכן נמצאו 5- ו-2-iodoindole נקשרים לקולטני GluCL בצורה חזקה יותר מאשר האינדולים האחרים שנבדקו (איור 6 ואיור משלים S8). נמצא כי היוד במיקום השני או החמישי של האינדול נקשר לאוצין 218 של קולטן ה-GluCL באמצעות קשרי מימן בעמוד השדרה, ואילו אינדולים הלוגנים אחרים ואינדול עצמו יוצרים קשרי מימן צדדיים חלשים עם סרין 260 (איור 6). לפיכך אנו משערים כי לוקליזציה של ההלוגן משחקת תפקיד חשוב בהשראת ניוון ואקוולרי, בעוד שהקישור ההדוק של 5-iodoindole שומר על תעלת היונים פתוחה, ובכך מאפשר זרימת נוזלים מהירה וקרע ואקואול. עם זאת, עדיין נותר לקבוע את מנגנון הפעולה המפורט של 5-iodoindole.
לפני יישום מעשי של 5-iodoindole, יש לנתח את ההשפעה הרעילה שלו על צמחים. ניסויי נביטת הזרעים שלנו הראו של-5-iodoindole לא הייתה השפעה שלילית על נביטת הזרעים או תהליכי הפיתוח הבאים בריכוזים שנחקרו (איור 7). לפיכך, מחקר זה מספק בסיס לשימוש ב-5-iodoindole בסביבה האקולוגית כדי לשלוט על הנזק של נמטודות אורן לעצי אורן.
דיווחים קודמים הוכיחו שטיפול מבוסס אינדול מייצג גישה פוטנציאלית לטיפול בבעיית העמידות לאנטיביוטיקה והתקדמות הסרטן55. בנוסף, לאינדולים יש פעילויות אנטיבקטריאליות, נוגדות סרטן, נוגדות חמצון, אנטי דלקתיות, נוגדות סוכרת, אנטי-ויראליות, אנטי-פרוליפרטיביות ואנטי-שחפת ועשויים לשמש בסיס מבטיח לפיתוח תרופות56,57. מחקר זה מציע לראשונה את השימוש הפוטנציאלי של יוד כחומר נוגד טפיל והאנטלמינציה.
Avermectin התגלה לפני שלושה עשורים וזכה בפרס נובל בשנת 2015, והשימוש בו כחומר אנטימלנטי עדיין נמשך באופן פעיל. עם זאת, בשל ההתפתחות המהירה של עמידות לאברמקטין בנמטודות ומזיקי חרקים, יש צורך באסטרטגיה חלופית, בעלות נמוכה וידידותית לסביבה כדי לשלוט בהידבקות PWN בעצי אורן. מחקר זה מדווח גם על המנגנון שבאמצעותו 5-iodoindole הורג נמטודות אורן וכי ל-5-iodoindole יש רעילות נמוכה לתאי צמחים, מה שפותח סיכויים טובים ליישום מסחרי עתידי שלו.
כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת Yeungnam, Gyeongsan, קוריאה, והשיטות בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של אוניברסיטת Yeungnam.
ניסויי דגירת ביצים בוצעו באמצעות נהלים מקובלים43. כדי להעריך את שיעורי הבקיעה (HR), נמטודות בוגרות בנות יום אחד (כ-100 נקבות ו-100 זכרים) הועברו לצלחות פטרי המכילות את הפטרייה והורשו לגדול במשך 24 שעות. לאחר מכן בודדו הביצים וטופלו ב-5-יודואינדול (0.05 mM ו-0.1 mM) או אברמקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) כתרחיף במים מזוקקים סטריליים. תרחיפים אלה (500 מיקרוליטר; כ-100 ביצים) הועברו לבורות של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות ודגרו ב-22 מעלות צלזיוס. ספירות L2 בוצעו לאחר 24 שעות של דגירה אך נחשבו מתות אם התאים לא זזו כאשר עוררו אותם בחוט פלטינה דק. ניסוי זה נערך בשני שלבים, כל אחד עם שש חזרות. הנתונים משני הניסויים אוחדו והוצגו. אחוז ה-HR חושב כדלקמן:
תמותה של זחלים הוערכה באמצעות נהלים שפותחו בעבר. ביצי נמטודות נאספו והעוברים סונכרנו על ידי בקיעה במים מזוקקים סטריליים ליצירת זחלים בשלב L2. זחלים מסונכרנים (כ-500 נמטודות) טופלו ב-5-iodoindole (0.05 mM ו-0.1 mM) או avermectin (10 מיקרוגרם/מ"ל) וגודלו על צלחות B. cinerea Petri. לאחר 48 שעות של דגירה ב-22 מעלות צלזיוס, נמטודות נאספו במים מזוקקים סטריליים ונבדקו לגבי נוכחותם של שלבי L2, L3 ו-L4. נוכחותם של שלבי L3 ו-L4 העידה על טרנספורמציה של הזחל, בעוד שנוכחות של שלב L2 לא הצביעה על טרנספורמציה. התמונות נרכשו באמצעות מערכת iRiS™ Digital Cell Imaging System. ניסוי זה נערך בשני שלבים, כל אחד עם שש חזרות. הנתונים משני הניסויים שולבו והוצגו.
הרעילות של 5-iodoindol ושל avermectin לזרעים הוערכה באמצעות בדיקות נביטה על לוחות Murashige ו-Skoog אגר.62 זרעי B. oleracea ו-R. raphanistrum הושרו תחילה במים מזוקקים סטריליים למשך יום אחד, נשטפו עם 1 מ"ל 100% אתנול מסחרי, 50% אתנול 100% 30% 1. 15 דקות, ושטף חמש פעמים עם 1 מ"ל מים סטריליים. לאחר מכן, הזרעים המעוקרים נלחצו על לוחות אגר נביטה המכילים 0.86 גרם/ליטר (0.2X) בינוני Murashige ו-Skoog ו-0.7% אגר בקטריולוגי עם או בלי 5-iodoindole או avermectin. הצלחות הודגרו ב-22 מעלות צלזיוס, ותמונות צולמו לאחר 3 ימי דגירה. ניסוי זה נערך בשני שלבים, שלכל אחד מהם היו שש חזרות.