הערכת יוד ואברמקטין כגורמים להתפתחות מחלת נמטודות באורן

נמטודת האורן היא אנדוטפיל נודד בהסגר הידוע כגורם להפסדים כלכליים חמורים במערכות אקולוגיות של יערות אורנים. המחקר הנוכחי סוקר את הפעילות הנמטיצידלית של אינדולים הלוגניים כנגד נמטודות אורן ואת מנגנון הפעולה שלהם. הפעילות הנמטיצידלית של 5-יודואינדול ואברמקטין (ביקורת חיובית) כנגד נמטודות אורן הייתה דומה וגבוהה בריכוזים נמוכים (10 מיקרוגרם/מ"ל). 5-יודואינדול הפחית את הפוריות, פעילות הרבייה, תמותת העוברים והזחלים והתנהגות תנועתית. אינטראקציות מולקולריות של ליגנדים עם קולטני תעלות כלוריד ספציפיים לחסרי חוליות המופעלים על ידי גלוטמט תומכות ברעיון ש-5-יודואינדול, כמו אברמקטין, נקשר בחוזקה לאתר הפעיל של הקולטן. 5-יודואינדול גרם גם לעיוותים פנוטיפיים שונים בנמטודות, כולל קריסה/הצטמקות חריגה של איברים ועלייה בוואקוליזציה. תוצאות אלו מצביעות על כך שווקואולים עשויים למלא תפקיד במוות בתיווך מתילציה של נמטודות. חשוב לציין, ש-5-יודואינדול לא היה רעיל לשני מיני הצמחים (כרוב וצנון). לפיכך, מחקר זה מדגים כי שימוש ביודואינדול בתנאי סביבה יכול לשלוט בפגיעה בקמילה של אורנים.
נמטודות עץ האורן (Bursaphelenchus xylophilus) שייכות לנמטודות עץ האורן (PWN), נמטודות אנדופרזיטיות נודדות הידועות כגורמות נזק אקולוגי חמור למערכות אקולוגיות של יערות אורנים1. מחלת נבילת האורנים (PWD) הנגרמת על ידי נמטודות עץ האורן הופכת לבעיה חמורה במספר יבשות, כולל אסיה ואירופה, ובצפון אמריקה הנמטודות הורסות מיני אורנים שהוכנסו1,2. דעיכת עצי האורן היא בעיה כלכלית משמעותית, והסיכוי להתפשטותם העולמית מדאיג3. מיני האורן הבאים מותקפים לרוב על ידי הנמטודות: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii, ו-Pinus radiata4. נמטודות עץ האורן הן מחלה חמורה שיכולה להרוג עצי אורן תוך שבועות או חודשים מההדבקה. בנוסף, התפרצויות של נמטודות עץ האורן שכיחות במגוון מערכות אקולוגיות, ולכן נוצרו שרשראות הדבקה מתמשכות1.
Bursaphelenchus xylophilus הוא נמטודה טפילית צמחית מסוג הסגר השייכת למשפחת העל Aphelenchoidea ולקבוצה 102.5. הנמטודה ניזונה מפטריות ומתרבה ברקמות העץ של עצי אורן, ומתפתחת לארבעה שלבי זחל שונים: L1, L2, L3, L4 ופרט בוגר1,6. בתנאי מחסור במזון, נמטודת האורן עוברת לשלב זחל מיוחד - dauer, אשר מטפיל את הווקטור שלה - חיפושית קליפת האורן (Monochamus alternatus) ומועברת לעצי אורן בריאים. במארחים בריאים, נמטודות נודדות במהירות דרך רקמות הצמח וניזונות מתאים פרנכימטיים, מה שמוביל למספר תגובות רגישות יתר, קמילה של האורן ומוות תוך שנה לאחר ההדבקה1,7,8.
הדברה ביולוגית של נמטודות אורן היוותה אתגר זה מכבר, כאשר אמצעי הסגר החלו עוד במאה ה-20. האסטרטגיות הנוכחיות לשליטה בנמטודות אורן כוללות בעיקר טיפולים כימיים, כולל חיטוי עץ והשתלת נמטודות בגזעי עצים. הנמטודות הנפוצות ביותר הן אברמקטין ואברמקטין בנזואט, השייכים למשפחת האוורמקטין. כימיקלים יקרים אלה יעילים מאוד כנגד מיני נמטודות רבים ונחשבים בטוחים לסביבה9. עם זאת, שימוש חוזר ונשנה בנמטודות אלה צפוי ליצור לחץ ברירה שיוביל כמעט בוודאות להופעתן של נמטודות אורן עמידות, כפי שהודגם עבור מספר מזיקי חרקים, כגון Leptinotarsa ​​decemlineata, Plutella xylostella והנמטודות Trichostrongylus colubriformis ו-Ostertagia circumcincta, אשר פיתחו בהדרגה עמידות לאברמקטין10,11,12. לכן, יש לחקור באופן קבוע דפוסי עמידות ולסנן באופן רציף את חומרי ההדברה של נמטודות כדי למצוא אמצעים חלופיים, חסכוניים וידידותיים לסביבה לשליטה ב-PVD. בעשורים האחרונים, מספר מחברים הציעו את השימוש בתמציות צמחים, שמנים אתריים וחומרים נדיפים כחומרי הדברה נמטודות 13,14,15,16.
לאחרונה הדגמנו את הפעילות הנמטיצידלית של אינדול, מולקולת איתות בין-תאית ובין-ממלכות, ב-Caenorhabditis elegans 17. אינדול הוא אות תוך-תאי נפוץ באקולוגיה מיקרוביאלית, השולט על תפקודים רבים המשפיעים על פיזיולוגיה מיקרוביאלית, היווצרות נבגים, יציבות פלסמיד, עמידות לתרופות, היווצרות ביופילם וארסיות 18, 19. פעילותו של אינדול ונגזרותיו כנגד נמטודות פתוגניות אחרות לא נחקרה. במחקר זה, חקרנו את הפעילות הנמטיצידלית של 34 אינדולים כנגד נמטודות אורן והבהרנו את מנגנון הפעולה של 5-יודואינדול החזק ביותר באמצעות מיקרוסקופיה, צילום בהילוך מהיר וניסויי עגינה מולקולרית, והערכנו את השפעותיו הרעילות על צמחים באמצעות מבחן נביטת זרעים.
ריכוזים גבוהים (>1.0 mM) של אינדול דווחו בעבר כבעלי השפעה נמטוצידלית על נמטודות17. לאחר טיפול ב-B. xylophilus (שלבי חיים מעורבים) עם אינדול או 33 נגזרות אינדול שונות בריכוז של 1 mM, נמדדה התמותה של B. xylophilus על ידי ספירת נמטודות חיות ומתות בקבוצת הביקורת ובקבוצת המטופלים. חמישה אינדולים הציגו פעילות נמטוצידלית משמעותית; ההישרדות של קבוצת הביקורת שלא טופלה הייתה 95 ± 7% לאחר 24 שעות. מתוך 34 האינדולים שנבדקו, 5-יודואינדול ו-4-פלואורואינדול בריכוז של 1 mM גרמו לתמותה של 100%, בעוד ש-5,6-דיפלואורואינדיגו, מתילינדול-7-קרבוקסילאט ו-7-יודואינדול גרמו לתמותה של כ-50% (טבלה 1).
השפעת 5-יודואינדול על היווצרות וואקואולות ומטבוליזם של נמטודות עץ אורן. (א) השפעת אברמקטין ו-5-יודואינדול על נמטודות זכרים בוגרות, (ב) ביצי נמטודות בשלב L1 ו-(ג) מטבוליזם של B. xylophilus, (i) וואקואולות לא נצפו ב-0 שעות, הטיפול הביא ל-(ii) וואקואולות, (iii) הצטברות של וואקואולות מרובות, (iv) נפיחות של וואקואולות, (v) איחוי וואקואולות ו-(vi) היווצרות וואקואולות ענקיות. חצים אדומים מצביעים על נפיחות של וואקואולות, חצים כחולים מצביעים על איחוי וואקואולות וחצים שחורים מצביעים על וואקואולות ענקיות. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
בנוסף, מחקר זה תיאר גם את התהליך הרציף של מוות מושרה על ידי מתאן בנמטודות אורן (איור 4C). מוות מתנוגני הוא סוג לא אפופטוטי של מוות תאי הקשור להצטברות של וואקולות ציטופלזמיות בולטות27. נראה כי הפגמים המורפולוגיים שנצפו בנמטודות אורן קשורים קשר הדוק למנגנון המוות המושרה על ידי מתאן. בדיקה מיקרוסקופית בזמנים שונים הראתה כי וואקולות ענקיות נוצרו לאחר 20 שעות של חשיפה ל-5-יודואינדול (0.1 mM). וואקולות מיקרוסקופיות נצפו לאחר 8 שעות של טיפול, ומספרן גדל לאחר 12 שעות. מספר וואקולות גדולות נצפו לאחר 14 שעות. מספר וואקולות מאוחות נראו בבירור לאחר 12-16 שעות של טיפול, דבר המצביע על כך שאיחוי וואקולות הוא הבסיס למנגנון המוות המתנוגני. לאחר 20 שעות, נמצאו מספר וואקולות ענקיות ברחבי התולעת. תצפיות אלו מייצגות את הדיווח הראשון על מטואוזיס ב-C. elegans.
בתולעים שטופלו ב-5-יודואינדול, נצפו גם צבירה וקרע של וואקואולות (איור 5), כפי שמעידים כיפוף התולעת ושחרור וואקואולות לסביבה. שיבוש וואקואולות נצפה גם בקרום קליפת הביצה, אשר בדרך כלל נשמרת שלמה על ידי L2 במהלך הבקיעה (איור משלים S2). תצפיות אלו תומכות במעורבות של הצטברות נוזלים וכשל אוסמורגולטורי, כמו גם פגיעה תאית הפיכה (RCI), בתהליך היווצרות וההתגלות של וואקואולות (איור 5).
בהשערת תפקידו של יוד ביצירת וואקואולות שנצפתה, חקרנו את הפעילות הנמטיצידלית של נתרן יודיד (NaI) ואשלגן יודיד (KI). עם זאת, בריכוזים (0.1, 0.5 או 1 mM), הם לא השפיעו על הישרדות הנמטודות או על היווצרות וואקואולות (איור משלים S5), למרות של-1 mM KI הייתה השפעה נמטיצידלית קלה. מצד שני, 7-יודאינדול (1 או 2 mM), כמו 5-יודאינדול, גרם לוואקואולות מרובות ועיוותים מבניים (איור משלים S6). שני היודאינדולים הראו מאפיינים פנוטיפיים דומים בנמטודות אורן, בעוד ש-NaI ו-KI לא עשו זאת. מעניין לציין, שאינדול לא גרם להיווצרות וואקואולות ב-B. xylophilus בריכוזים שנבדקו (נתונים לא מוצגים). לפיכך, התוצאות אישרו כי קומפלקס האינדול-יוד אחראי על ריקוליזה ומטבוליזם של B. xylophilus.
מבין האינדולים שנבדקו לפעילות נמטיצידלית, ל-5-יודואינדול היה מדד ההחלקה הגבוה ביותר של -5.89 קק"ל/מול, ואחריו 7-יודואינדול (-4.48 קק"ל/מול), 4-פלואורואינדול (-4.33) ואינדול (-4.03) (איור 6). קשר מימן חזק של 5-יודואינדול ללאוצין 218 מייצב את קישורו, בעוד שכל נגזרות האינדול האחרות נקשרות לסרין 260 באמצעות קשרי מימן בשרשרת צדדית. בין שאר היודואינדולים שעוצבו, ל-2-יודואינדול ערך קישור של -5.248 קק"ל/מול, הנובע מקשר המימן העיקרי שלו עם לאוצין 218. קישורים ידועים אחרים כוללים 3-יודואינדול (-4.3 קק"ל/מול), 4-יודואינדול (-4.0 קק"ל/מול) ו-6-פלואורואינדול (-2.6 קק"ל/מול) (איור משלים S8). רוב האינדולים ההלוגניים והאינדול עצמו, למעט 5-יודאינדול ו-2-יודאינדול, יוצרים קשר עם סרין 260. העובדה שקשרי מימן עם לאוצין 218 מעידים על קישור יעיל בין קולטן לליגנד, כפי שנצפה עבור איברמקטין (איור משלים S7), מאשרת ש-5-יודאינדול ו-2-יודאינדול, כמו איברמקטין, נקשרים בחוזקה לאתר הפעיל של קולטן GluCL דרך לאוצין 218 (איור 6 ואיור משלים S8). אנו מציעים שקישור זה נדרש כדי לשמור על מבנה הנקבוביות הפתוחות של קומפלקס GluCL, וכי על ידי קישור חזק לאתר הפעיל של קולטן GluCL, 5-יודאינדול, 2-יודאינדול, אברמקטין ואיברמקטין שומרים על תעלת היונים פתוחה ומאפשרים ספיגת נוזלים.
עגינה מולקולרית של אינדול ואינדול הלוגני ל-GluCL. אוריינטציות קישור של ליגנדים (A) אינדול, (B) 4-פלואורואינדול, (C) 7-יודואינדול ו-(D) 5-יודואינדול לאתר הפעיל של GluCL. החלבון מיוצג על ידי סרט, וקשרי המימן של עמוד השדרה מוצגים כקווים מקווקווים צהובים. (A′), (B′), (C′) ו-(D′) מראים את האינטראקציות של הליגנדים המתאימים עם שיירי חומצות האמינו הסובבות, וקשרי המימן של שרשרת הצד מסומנים בחצים ורודים מקווקווים.
נערכו ניסויים כדי להעריך את ההשפעה הרעילה של 5-יודואינדול על נביטת זרעי כרוב וצנון. ל-5-יודואינדול (0.05 או 0.1 mM) או אברמקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) הייתה השפעה מועטה או ללא השפעה כלל על הנביטה הראשונית ועל צמיחת השתילים (איור 7). בנוסף, לא נמצא הבדל משמעותי בין קצב הנביטה של ​​קבוצת ביקורת שלא טופלה לבין זרעים שטופלו ב-5-יודואינדול או אברמקטין. ההשפעה על התארכות שורשי הקצה ומספר השורשים הצדדיים שנוצרו הייתה חסרת משמעות, אם כי 1 mM (פי 10 מהריכוז הפעיל שלו) של 5-יודואינדול עיכב מעט את התפתחות השורשים הצדדיים. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-5-יודואינדול אינו רעיל לתאי צמחים ואינו מפריע לתהליכי התפתחות הצמח בריכוזים שנחקרו.
השפעת 5-יודואינדול על נביטת זרעים. נביטה, הנבטה והשרשה רוחבית של זרעי B. oleracea ו-R. raphanistrum על מצע אגר מוראשיגה וסקוג עם או בלי אברמקטין או 5-יודואינדול. הנביטה נרשמה לאחר 3 ימי דגירה ב-22°C.
מחקר זה מדווח על מספר מקרים של הריגת נמטודות על ידי אינדולים. חשוב לציין, שזהו הדיווח הראשון על מתילציה (תהליך הנגרם על ידי הצטברות של וואקולות קטנות המתמזגות בהדרגה לוואקולות ענקיות, ובסופו של דבר מובילות לקרע ומוות של הממברנה) במחטי אורן על ידי יודואינדול, כאשר יודואינדול מציג תכונות נמטוצידיות משמעותיות הדומות לאלו של הנמטוצין המסחרי אברמקטין.
בעבר דווח כי אינדולים מפעילים מספר פונקציות איתות בפרוקריוטים ואאוקריוטים, כולל עיכוב/יצירת ביופילם, הישרדות חיידקים ופתוגניות19,32,33,34. לאחרונה, ההשפעות הטיפוליות הפוטנציאליות של אינדולים הלוגניים, אלקלואידים של אינדול ונגזרות אינדול חצי-סינתטיות משכו עניין מחקרי נרחב35,36,37. לדוגמה, הוכח כי אינדולים הלוגניים הורגים תאים עקשניים של אשריכיה קולי וסטפילוקוקוס אאורוס37. בנוסף, יש עניין מדעי לחקור את יעילותם של אינדולים הלוגניים כנגד מינים, סוגים וממלכות אחרים, ומחקר זה הוא צעד לקראת השגת מטרה זו.
כאן, אנו מציעים מנגנון לתמותה הנגרמת על ידי 5-יודואינדול בתאי C. elegans, המבוסס על פגיעה תאית הפיכה (RCI) ומתילציה (איורים 4C ו-5). שינויים בצקתיים כגון נפיחות וניוון וואקואולי הם אינדיקטורים ל-RCI ולמתילציה, המתבטאים כוואקואולות ענקיות בציטופלזמה 48,49. RCI מפריע לייצור אנרגיה על ידי הפחתת ייצור ATP, גרימת כשל של משאבת ATPase, או שיבוש קרומי התא וגורם לזרימה מהירה של Na+, Ca2+ ומים 50,51,52. וואקואולות תוך-ציטופלזמיות נוצרות בתאי בעלי חיים כתוצאה מהצטברות נוזלים בציטופלזמה עקב זרימת Ca2+ ומים 53. מעניין לציין, שמנגנון זה של נזק לתאים הוא הפיך אם הנזק זמני והתאים מתחילים לייצר ATP למשך פרק זמן מסוים, אך אם הנזק נמשך או מחמיר, התאים מתים.54 התצפיות שלנו מראות כי נמטודות שטופלו ב-5-יודואינדול אינן מסוגלות לשקם ביוסינתזה תקינה לאחר חשיפה לתנאי עקה.
ייתכן שפנוטיפ המתילציה המושרה על ידי 5-יודואינדול ב-B. xylophilus נובע מנוכחות יוד ומהתפלגותו המולקולרית, מכיוון של-7-יודואינדול הייתה השפעה מעכבת פחותה על B. xylophilus מאשר ל-5-יודואינדול (טבלה 1 ואיור משלים S6). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקריהם של Maltese et al. (2014), שדיווחו כי טרנסלוקציה של קבוצת החנקן הפירידיל באינדול מעמדת הפרה- לעמדת המטא ביטלה את הוואקואליזציה, עיכוב הגדילה והציטוטוקסיות בתאי U251, דבר המצביע על כך שהאינטראקציה של המולקולה עם אתר פעיל ספציפי בחלבון היא קריטית27,44,45. האינטראקציות בין אינדולים אינדול או אינדולים הלוגניים לקולטני GluCL שנצפו במחקר זה תומכות גם הן ברעיון זה, שכן נמצא כי 5- ו-2-יודואינדול נקשרים לקולטני GluCL חזק יותר מאשר האינדולים האחרים שנבדקו (איור 6 ואיור משלים S8). נמצא כי היוד במיקום השני או החמישי של האינדול נקשר ללאוצין 218 של קולטן GluCL דרך קשרי מימן בעמוד השדרה, בעוד שאינדולים הלוגניים אחרים והאינדול עצמו יוצרים קשרי מימן חלשים בשרשרת צדדית עם סרין 260 (איור 6). לכן, אנו משערים כי לוקליזציה של ההלוגן ממלאת תפקיד חשוב בגרימת ניוון וואקולרי, בעוד שהקשירה ההדוקה של 5-יודואינדול שומרת על תעלת היונים פתוחה, ובכך מאפשרת זרימת נוזלים מהירה וקרע וואקולרי. עם זאת, מנגנון הפעולה המפורט של 5-יודואינדול טרם נקבע.
לפני היישום המעשי של 5-יודואינדול, יש לנתח את השפעתו הרעילה על צמחים. ניסויי נביטת הזרעים שלנו הראו כי ל-5-יודואינדול לא הייתה השפעה שלילית על נביטת הזרעים או על תהליכי ההתפתחות המאוחרים יותר בריכוזים שנחקרו (איור 7). לפיכך, מחקר זה מספק בסיס לשימוש ב-5-יודואינדול בסביבה האקולוגית כדי לשלוט בנזקי נמטודות האורן לעצי האורן.
דיווחים קודמים הראו כי טיפול מבוסס אינדול מייצג גישה פוטנציאלית לטיפול בבעיית העמידות לאנטיביוטיקה והתקדמות הסרטן55. בנוסף, לאינדולים יש פעילויות אנטיבקטריאליות, נוגדות סרטן, נוגדות חמצון, נוגדות דלקת, נוגדות סוכרת, אנטי-ויראליות, נוגדות שגשוג ונוגדות שחפת, ועשויים לשמש בסיס מבטיח לפיתוח תרופות56,57. מחקר זה מציע לראשונה את השימוש הפוטנציאלי ביוד כחומר אנטי-פרזיטי ונוגד תולעים.
אוורמקטין התגלה לפני שלושה עשורים וזכה בפרס נובל בשנת 2015, והשימוש בו כחומר תולעת עדיין נמשך באופן פעיל. עם זאת, עקב ההתפתחות המהירה של עמידות לאוורמקטין בנמטודות ובמזיקי חרקים, נדרשת אסטרטגיה חלופית, זולה וידידותית לסביבה כדי לשלוט בזיהום של עצי אורן (PWN) בעצי אורן. מחקר זה מדווח גם על המנגנון שבו 5-יודואינדול הורג נמטודות אורן וכי ל-5-יודואינדול רעילות נמוכה לתאי צמחים, דבר הפותח סיכויים טובים ליישום מסחרי עתידי שלו.
כל הניסויים אושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת יאנגנאם, גיונגסאן, קוריאה, והשיטות בוצעו בהתאם להנחיות ועדת האתיקה של אוניברסיטת יאנגנאם.
ניסויי דגירת ביצים בוצעו באמצעות נהלים מקובלים43. כדי להעריך את שיעורי הבקיעה (HR), נמטודות בוגרות בנות יום אחד (כ-100 נקבות ו-100 זכרים) הועברו לצלחות פטרי המכילות את הפטרייה והורשו לגדול במשך 24 שעות. לאחר מכן בודדו הביצים וטופלו ב-5-יודואינדול (0.05 mM ו-0.1 mM) או אברמקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) כתרחיף במים מזוקקים סטריליים. תרחיפים אלה (500 מיקרוליטר; כ-100 ביצים) הועברו לבורות של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות ודגרו ב-22 מעלות צלזיוס. ספירות L2 בוצעו לאחר 24 שעות של דגירה אך נחשבו מתות אם התאים לא זזו כאשר עוררו אותם בחוט פלטינה דק. ניסוי זה נערך בשני שלבים, כל אחד עם שש חזרות. הנתונים משני הניסויים אוחדו והוצגו. אחוז ה-HR חושב כדלקמן:
תמותת הזחלים הוערכה באמצעות הליכים שפותחו בעבר. ביצי נמטודות נאספו והעוברים סונכרנו על ידי בקיעה במים מזוקקים סטריליים כדי ליצור זחלים בשלב L2. זחלים מסונכרנים (כ-500 נמטודות) טופלו ב-5-יודואינדול (0.05 mM ו-0.1 mM) או אברמקטין (10 מיקרוגרם/מ"ל) וגודלו על פלטות פטרי של B. cinerea. לאחר 48 שעות של דגירה ב-22 מעלות צלזיוס, הנמטודות נאספו במים מזוקקים סטריליים ונבדקו לנוכחות שלבים L2, L3 ו-L4. נוכחות שלבים L3 ו-L4 הצביעה על טרנספורמציה של הזחל, בעוד שנוכחות שלב L2 הצביעה על חוסר טרנספורמציה. התמונות נרכשו באמצעות מערכת הדמיית התאים הדיגיטלית iRiS™. ניסוי זה נערך בשני שלבים, כל אחד עם שש חזרות. הנתונים משני הניסויים אוחדו והוצגו.
הרעילות של 5-יודואינדול ואברמקטין לזרעים הוערכה באמצעות מבחני נביטה על פלטות אגר מוראשיגה וסקוג.62 זרעי B. oleracea ו-R. raphanistrum הושרו תחילה במים מזוקקים סטריליים למשך יום אחד, נשטפו עם 1 מ"ל אתנול 100%, עוקרו עם 1 מ"ל אקונומיקה מסחרית 50% (3% נתרן היפוכלוריט) למשך 15 דקות, ונשטפו חמש פעמים עם 1 מ"ל מים סטריליים. לאחר מכן, הזרעים המעוקרים נלחצו על פלטות אגר נביטה המכילות 0.86 גרם/ליטר (0.2X) מדיום מוראשיגה וסקוג ו-0.7% אגר בקטריולוגי עם או בלי 5-יודואינדול או אברמקטין. לאחר מכן, הפלטות הודגרו ב-22 מעלות צלזיוס, ותמונות צולמו לאחר 3 ימי דגירה. ניסוי זה נערך בשני שלבים, שבכל אחד מהם היו שש חזרות.