תודה שביקרת ב-Nature.com.לגרסת הדפדפן שבה אתה משתמש יש תמיכת CSS מוגבלת.לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן שלך (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer).בינתיים, כדי להבטיח תמיכה שוטפת, אנו מציגים את האתר ללא סטיילינג או JavaScript.
הגילוי והשימוש המועיל במוצרים טבעיים יכולים לסייע בשיפור חיי האדם.כימיקלים מעכבי צמיחת צמחים נמצאים בשימוש נרחב כקוטלי עשבים להדברת עשבים שוטים.בשל הצורך בשימוש בסוגים שונים של קוטלי עשבים, ישנו צורך בזיהוי תרכובות בעלות מנגנוני פעולה חדשים.במחקר זה, גילינו תרכובת N-alkoxypyrrole חדשה, קוממונאמיד, מ-Streptomyces werraensis MK493-CF1 והקמנו את תהליך הסינתזה המלא.באמצעות מבחני פעילות ביולוגית, גילינו שחומצה urs-monoamic היא תוצר ביניים סינתטי של urs-monoamide ופוטנציאליתמעכב צמיחת צמחים.בנוסף, פיתחנו נגזרות שונות של חומצה אורבנונית, ביניהן נגזרת האורבנילוקסי (UDA), בעלת פעילות קוטל עשבים גבוהה מבלי להשפיע לרעה על הצמיחה של תאי HeLa.מצאנו גם שנגזרות של חומצה אורמוטונית משבשות את המיקרוטובולים של הצמח;בנוסף, KAND משפיע על חוטי האקטין וגורם למוות של תאים;השפעות רב-גוניות אלו שונות מאלו של מעכבי מיקרוטובולה ידועים ומציעות מנגנון פעולה חדש לחומצה אורסונית, המהווה יתרון חשוב בפיתוח קוטלי עשבים חדשים.
גילוי ויישום מעשי של מוצרים טבעיים מועילים ונגזרותיהם הוא אמצעי לשיפור איכות חיי האדם.מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי מיקרואורגניזמים, צמחים וחרקים הובילו להתקדמות גדולה ברפואה ובחקלאות.אנטיביוטיקה ותרופות נגד לוקמיה רבות פותחו ממוצרים טבעיים.בנוסף, סוגים שונים שלחומרי הדברה, קוטלי פטריות וקוטלי עשבים מופקים ממוצרים טבעיים אלה לשימוש בחקלאות.בפרט, קוטלי עשבים להדברת עשבים הם כלי חשוב להגדלת יבול היבול בחקלאות המודרנית, וכבר נעשה שימוש מסחרי בסוגים שונים של תרכובות.מספר תהליכים תאיים בצמחים, כגון פוטוסינתזה, מטבוליזם של חומצות אמינו, סינתזת דופן התא, ויסות מיטוזה, איתות פיטו-הורמונים או סינתזת חלבון, נחשבים למטרות טיפוסיות של קוטלי עשבים.תרכובות המעכבות את תפקוד המיקרוטובוליות הן סוג נפוץ של קוטלי עשבים המשפיעים על צמיחת הצמח על ידי השפעה על ויסות מיטוטי2.
מיקרו-צינוריות הן מרכיבים של השלד הציטוניים והן נשמרות באופן נרחב בתאים איקריוטים.ההטרודימר של טובולין מורכב מ-α-טובולין ו-β-טובולין היוצרים פרוטו-פילמנטים ליניאריים של מיקרו-טובולין, כאשר 13 פרוטו-פילמנטים יוצרים מבנה גלילי.מיקרוטובולים ממלאים תפקידים מרובים בתאי הצמח, כולל קביעת צורת התא, חלוקת התא והובלה תוך תאית3,4.תאי צמחים מכילים מיקרו-צינוריות מתחת לממברנת הפלזמה הבין-פאזית, ומה שנקרא מיקרו-צינוריות קליפת המוח הללו נחשבות לשלוטות בארגון של מיקרו-סיבי תאית באמצעות ויסות קומפלקסים של סינתאז תאית4,5.מיקרו-צינוריות קליפת המוח של תאי אפידרמיס שורש, הנמצאים באזור ההתארכות המהירה של קצה השורש, ממוקמות לרוחב, ומיקרו-סיבי תאית עוקבים אחר המיקרו-צינוריות הללו ומגבילים את כיוון התפשטות התאים, ובכך מקדמים התארכות תאים אנזוטרופית.לכן, תפקוד המיקרוטובולי קשור קשר הדוק למורפולוגיה של הצמח.תחליפי חומצות אמינו בגנים המקודדים טובולין גורמים להטיה של מערכי מיקרו-צינוריות קליפת המוח ולצמיחה בצד שמאל או ימין בארבידופסיס 6,7.באופן דומה, מוטציות בחלבונים הקשורים למיקרוטובוליות המווסתות את הדינמיקה של המיקרוטובוליות יכולות להוביל גם לגידול שורשים מעוות8,9,10,11,12,13.בנוסף, טיפול בקוטלי עשבים משבשי מיקרוטובוליות כגון דיספירמיד, הידוע גם בשם Pretilachlor, גורם אף הוא לצמיחת שורשים אלכסוניים בצד שמאל14.נתונים אלה מצביעים על כך שוויסות מדויק של תפקוד המיקרוטובולי הוא קריטי לקביעת כיוון צמיחת הצמח.
סוגים שונים של מעכבי מיקרוטובולה התגלו, ולתרופות אלו תרמו תרומות משמעותיות לחקר הציטו-שלד, כמו גם לחקלאות ולרפואה2.בפרט, תרכובות אוריזלין, דיניטרואנילין, דיספירמיד, תרכובות הקשורות לבנזמיד והאנלוגים שלהן יכולים לעכב את תפקוד המיקרוטובוליות ובכך לעכב את צמיחת הצמח.לכן, הם נמצאים בשימוש נרחב כקוטלי עשבים.עם זאת, מכיוון שמיקרוטובולים הם מרכיב חשוב בתאי צמחים ובעלי חיים, רוב מעכבי המיקרוטובוליים הם ציטוטוקסיים לשני סוגי התאים.לכן, למרות התועלת המוכרת שלהם כקוטלי עשבים, משתמשים במספר מוגבל של חומרים אנטי-מיקרוטובליים למטרות מעשיות.
Streptomyces הוא סוג ממשפחת Streptomyces, הכולל חיידקים אירוביים, גרם חיוביים, חוטיים וידוע ביכולתו לייצר מגוון רחב של מטבוליטים משניים.לכן, הוא נחשב לאחד המקורות החשובים ביותר של מוצרים טבעיים פעילים ביולוגית חדשים.במחקר הנוכחי, גילינו תרכובת חדשה בשם קוממונאמיד, אשר בודדה מ-Streptomyces werraensis MK493-CF1 ו-S. werraensis ISP 5486. באמצעות אנליזה ספקטרלית וניתוח ספקטרלי מלא, אופיינה המבנה של קוממונאמיד ושלד N-alkoxypyrrole הייחודי שלו הוחלט.סִינתֶזָה.חומצה אורסמונית, תוצר ביניים סינטטי של אורסמונואמיד ונגזרותיו, נמצאה כמעכבת את הצמיחה והנביטה של צמח הדגם הפופולרי Arabidopsis thaliana.במחקר קשרי מבנה-פעילות, מצאנו כי תרכובת עם C9 שונה לחומצה אורסונית, הנקראת נגזרת נונילוקסי של חומצה אורסונית (KAND), משפרת באופן משמעותי את ההשפעה המעכבת על גדילה ונביטה.יש לציין כי מעכב הצמיחה החדש שהתגלה השפיע גם על הצמיחה של טבק וצמח כבד ולא היה ציטוטוקסי לחיידקים או לתאי HeLa.יתרה מכך, כמה נגזרות של חומצה אורמוטונית מעוררות פנוטיפ שורש מעוות, מה שמרמז שנגזרות אלה משפיעות ישירות או בעקיפין על מיקרוטובולים.בהתאם לרעיון זה, התצפיות שלנו על מיקרוטובולים המסומנים באופן אימונוהיסטוכימי או עם חלבונים פלואורסצנטיים מצביעים על כך שטיפול KAND משחרר מיקרוטובולים.בנוסף, טיפול בנגזרות חומצה קוממוטונית שיבש מיקרופילמנטים של אקטין.כך, גילינו מעכב צמיחה חדש של צמחים שמנגנון הפעולה הייחודי שלו כרוך בהרס של שלד הציטוס.
זן MK493-CF1 בודד מאדמה ב-Shinagawa-ku, טוקיו.זן MK493-CF1 יצר תפטיר סטרומלי מסועף היטב.נקבע הרצף החלקי של הגן הריבוזומלי RNA 16S (1422 bp).זן זה דומה מאוד ל-S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: זן טיפוסי, 99.93%).בהתבסס על תוצאה זו, נקבע כי זן זה קשור קשר הדוק לזן מסוג S. werraensis.לכן, קראנו באופן זמני לזן זה S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T מייצרת גם את אותן תרכובות ביו-אקטיביות.מכיוון שהיה מעט מחקר מוקדם להשגת מוצרים טבעיים ממיקרואורגניזם זה, בוצע מחקר כימי נוסף.לאחר טיפוח של S. werraensis MK493-CF1 על מדיום שעורה על ידי תסיסה במצב מוצק ב-30 מעלות צלזיוס למשך 14 ימים, המדיום חולץ עם 50% EtOH.60 מ"ל של דגימה יובשו לקבלת 59.5 מ"ג של תמצית גולמית.התמצית הגולמית הועברה ל-HPLC פאזה הפוכה כדי לתת N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, בשם קוממונאמיד, 36.0 מ"ג).הכמות הכוללת של 1 היא בערך 60% מהתמצית הגולמית.לכן, החלטנו ללמוד בפירוט את המאפיינים של קוממוטואמיד 1.
Coumamonamide 1 היא אבקה אמורפית לבנה וספקטרומטריית מסה ברזולוציה גבוהה (HRESIMS) מאשרת C6H8N2O2 (איור 1).שבר הפירול המוחלף ב-C2 של תרכובת זו מאופיין ב-δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH בספקטרום 1H NMR: 4.5 Hz , H-5) ו-δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), וספקטרום 13C NMR מראה נוכחות של ארבעה אטומי פחמן sp2.נוכחותה של קבוצת אמיד במיקום C2 הוערכה על ידי מתאם HMBC מהפרוטון C-3 לפחמן הקרבוניל האמיד ב-δC 161.1.בנוסף, פסגות 1H ו-13 C NMR ב-δH 4.10 (3H, S) ו-δC 68.3 מצביעים על נוכחות של קבוצות N-methoxy במולקולה.למרות שהמיקום הנכון של קבוצת המתוקסי טרם נקבע באמצעות ניתוח ספקטרוסקופי כגון ספקטרוסקופיה מוגברת של הבדל וקיצור גרעיני Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide הפך לתרכובת המועמדת הראשונה.
כדי לקבוע את המבנה הנכון של 1, בוצעה סינתזה כוללת (איור 2א).טיפול ב-2-aminopyridine 2 זמין מסחרית עם m-CPBA הביא ל-N-oxide 3 המקביל בתשואה כמותית.לאחר ה-2-aminoazidation של 2, תגובת הציקלוקוננסציה שתוארה על ידי אברמוביץ' בוצעה בבנזן ב-90 מעלות צלזיוס כדי להשיג את ה-1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile הרצוי 5 בגרם.מהירות 60% (שני שלבים).15,16.מתילציה והידרוליזה של 4 לאחר מכן נתנו חומצה 1-מתוקסי-1H-פירול-2-קרבוקסילית (שנקראת "חומצה קומוטון", 6) בתשואה טובה (70%, שני שלבים).לבסוף, אמידציה באמצעות חומר ביניים חומצה כלוריד 6 באמצעות אמוניה מימית נתנה ל-Kumamoto Amide 1 בתשואה של 98%.כל הנתונים הספקטרליים של 1 מסונתז היו דומים ל-1 מבודד, כך שהמבנה של 1 נקבע;
סינתזה וניתוח כללי של הפעילות הביולוגית של אורבנאמיד וחומצה אורבנית.(א) סינתזה כוללת של אמיד קוממוטו.(ב) שתילי Arabidopsis Columbia (Col) בני שבעה ימים גודלו על צלחות Murashige ו-Skoog (MS) המכילות קוממונאמיד 6 או קוממונאמיד 1 בריכוזים המצוינים.פס קנה מידה = 1 ס"מ.
ראשית, הערכנו את הפעילויות הביולוגיות של urbenamide וחומרי הביניים שלו עבור יכולתם לווסת את צמיחת הצמח.הוספנו ריכוזים שונים של ursmonamide 1 או ursmonic acid 6 למדיום אגר MS ושתילי Arabidopsis thaliana מתורבתים על המדיום הזה.מבחני אלה הראו כי ריכוזים גבוהים (500 מיקרומטר) של 6 עיכבו את צמיחת השורשים (איור 2ב).לאחר מכן, יצרנו נגזרות שונות על ידי החלפת מיקום N1 של 6 וביצענו עליהן מחקרי קשרי מבנה-פעילות (תהליך הסינתזה האנלוגי מתואר במידע התומך (SI)).שתילי ארבידופסיס גודלו על מצע המכיל 50 מיקרומטר נגזרות של חומצה אורסונית, ואורך השורשים נמדד.כפי שמוצג בתמונה.כפי שמוצג באיורים 3a, b ו-S1, לחומצות קוממו יש אורכים שונים של שרשראות אלקוקסי ליניאריות (9, 10, 11, 12 ו-13) או שרשראות אלקוקסי גדולות (15, 16 ו-17) במיקום N1.הנגזרות הראו עיכוב משמעותי של צמיחת השורשים.בנוסף, מצאנו שיישום של 200 מיקרומטר 10, 11 או 17 עיכב נביטה (איורים 3c ו-S2).
מחקר של קשר המבנה-פעילות של קוממוטו אמיד ותרכובות קשורות.(א) ערכת מבנה וסינתזה של אנלוגים.(ב) כימות של אורך השורש של שתילים בני 7 ימים שגדלו על מדיום MS עם או בלי 50 מיקרומטר נגזרות קוממונאמיד.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בטיפול מדומה (מבחן t, עמ'< 0.05).n>18. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD.nt פירושו "לא נבדק" כי יותר מ-50% מהזרעים לא נבטו.(ג) כימות קצב הנביטה של זרעים מטופלים שהודגרו במשך 7 ימים במדיום MS עם או בלי 200 מיקרומטר קוממונאמיד ותרכובות קשורות.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בטיפול דמה (בדיקת צ'י ריבוע).n=96.
מעניין לציין שתוספת של שרשראות צד אלקיל ארוכות מ-C9 הפחיתה את הפעילות המעכבת, מה שמרמז שתרכובות הקשורות לחומצה קוממוטואית דורשות שרשראות צד בגודל מסוים כדי להציג את הפעילות הביולוגית שלהן.
מכיוון שניתוח קשרי מבנה-פעילות הראה ש-C9 שונה לחומצה אורסונית ונגזרת הנונילוקסי של חומצה אורסונית (להלן KAND 11) הייתה מעכב הצמיחה הצמחי היעיל ביותר, ערכנו אפיון מפורט יותר של KAND 11. טיפול בארבידופסיס עם 50 מיקרומטר KAND 11 מנעו כמעט לחלוטין נביטה, בעוד שריכוזים נמוכים יותר (40, 30, 20 או 10 מיקרומטר) של KAND 11 עיכבו את צמיחת השורשים באופן תלוי מינון (איור 4א, ב).כדי לבדוק האם KAND 11 משפיע על כדאיות שורש מריסטם, בדקנו מריסטמי שורש שנצבעו ב-propidium iodide (PI) ומדדנו את גודל שטח המריסטם.גודל המריסטם של שתילים שגדלו על מצע המכיל 25 מיקרומטר KAND-11 היה 151.1 ± 32.5 מיקרומטר, בעוד שגודל המריסטם של שתילים שגדלו על מדיום בקרה המכיל DMSO היה 264.7 ± 30.8 מיקרומטר (איור 4c, d) , מה שמעיד על כך ש-KAND-11 משחזר את הפעילות הסלולרית.פְּרִיסָה.שורש מריסטם.בהתאם לכך, טיפול ב-KAND 11 הפחית את כמות סמן חלוקת התא CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS אות במריסטם השורש (איור 4ה) 17.תוצאות אלו מצביעות על כך ש-KAND 11 מעכב את צמיחת השורשים על ידי הפחתת פעילות התפשטות התאים.
ניתוח ההשפעה המעכבת של נגזרות חומצה אורבנונית (נגזרות אורבנילוקסי) על הצמיחה.(א) שתילי קול מסוג בר בני 7 ימים שגדלו על צלחות MS עם הריכוזים המצוינים של KAND 11. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ.(ב) כימות אורך השורש.אותיות מצביעות על הבדלים משמעותיים (בדיקת Tukey HSD, עמ'< 0.05).n>16. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD.(ג) מיקרוסקופיה קונפוקלית של שורשי קול מסוג פראי מוכתם ביודיד שגדלו על לוחות טרשת נפוצה עם או בלי 25 מיקרומטר KAND 11. סוגריים לבנים מצביעים על מריסטם שורש.סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.(ד) כימות של גודל מריסטם שורש (n = 10 עד 11).הבדלים סטטיסטיים נקבעו באמצעות מבחן t (עמ'< 0.05).הפסים מייצגים את גודל המריסטם הממוצע.(ה) מיקרוסקופיה של ניגוד הפרעות דיפרנציאלי (DIC) של מריסטם שורש המכיל את מבנה CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS מוכתם ומוכתם על שתילים בני 5 ימים שגדלו על צלחות MS עם או בלי 25 µM KAND.
הפיטוטוקסיות של KAND 11 נבדקה עוד באמצעות צמח דו-צידי אחר, טבק (Nicotiana tabacum), ואורגניזם עיקרי של צמח יבשתי, כבד (Marchantia polymorpha).כמו במקרה של Arabidopsis, שתילי טבק SR-1 שגדלו על מדיום המכיל 25 מיקרומטר KAND 11 יצרו שורשים קצרים יותר (איור 5a).בנוסף, 40 מתוך 48 זרעים נבטו על צלחות המכילות 200 מיקרומטר KAND 11, בעוד שכל 48 הזרעים נבטו על מדיה שטופלה מדומה, מה שמצביע על כך שריכוזים גבוהים יותר של KAND היו משמעותיים (p< 0.05;chi test -square) עיכב את הנביטה של טבק.(איור 5ב).בנוסף, הריכוז של KAND 11 שעכב את צמיחת החיידקים בכבד היה דומה לריכוז היעיל בארבידופסיס (איור 5c).תוצאות אלו מצביעות על כך ש-KAND 11 יכול לעכב את הצמיחה של מגוון צמחים.לאחר מכן חקרנו את הציטוטוקסיות האפשרית של תרכובות הקשורות במונואמיד לדוב באורגניזמים אחרים, כלומר תאי HeLa אנושיים וזן Escherichia coli DH5α, כנציגים של תאים בעלי חיים וחיידקים גבוהים יותר, בהתאמה.בסדרה של מבחני התפשטות תאים, ראינו שקוממונאמיד 1, חומצה קוממונאמידית 6 ו-KAND 11 לא השפיעו על הצמיחה של תאי HeLa או E. coli בריכוזים של 100 מיקרומטר (איור 5d,e).
עיכוב גדילה של KAND 11 באורגניזמים שאינם ערבידופסיס.(א) שתילי טבק בר מסוג SR-1 בני שבועיים גודלו על צלחות MS הממוקמות אנכית המכילות 25 מיקרומטר KAND 11. (ב) שתילי טבק מסוג בר מסוג SR-1 בני שבועיים גודלו במיקום אופקי צלחות MS המכילות 200 מיקרומטר KAND 11. (ג) ניצני בר מסוג Tak-1 בני שבועיים שגדלו על לוחות Gamborg B5 עם הריכוזים המצוינים של KAND 11. חיצים אדומים מצביעים על נבגים שהפסיקו לגדול במהלך הדגירה של שבועיים פרק זמן.(ד) בדיקת התפשטות תאים של תאי HeLa.מספר התאים הקיימא נמדד במרווחי זמן קבועים באמצעות ערכת ספירת תאים 8 (Dojindo).כביקורת, תאי HeLa טופלו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל אקטינומיצין D (אקט D), המעכב את שעתוק ה-RNA פולימראז וגורם למוות של תאים.הניתוחים בוצעו בשלושה עותקים.(ה) בדיקת התפשטות תאי E. coli.צמיחת E. coli נותחה על ידי מדידת OD600.כביקורת, תאים טופלו ב-50 מיקרוגרם/מ"ל אמפיצילין (Amp), המעכב את סינתזת דופן התא החיידקי.הניתוחים בוצעו בשלושה עותקים.
כדי לפענח את מנגנון הפעולה של ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרכובות הקשורות לאוראמיד, ניתחנו מחדש נגזרות של חומצה אורבנית עם השפעות מעכבות מתונות.כפי שמוצג בתמונה.כפי שמוצג באיורים 2b, 6a, שתילים שגדלו על לוחות אגר המכילים ריכוזים גבוהים (200 מיקרומטר) של חומצה אורמוטונית 6 יצרו שורשים קצרים יותר ומעוקלים שמאלה (θ = – 23.7 ± 6.1), בעוד של שתילים שגדלו על מדיום הבקרה, שתילים ייצרו שורשים כמעט ישרים (θ = – 3.8 ± 7.1).ידוע כי גידול אלכסוני אופייני זה נובע מתפקוד לקוי של מיקרוטובולים בקליפת המוח14,18.בהתאם לממצא זה, התרופות המעורערות במיקרו-צינוריות דיסופרמיד ואוריזלין גרמו להטיית שורש דומה בתנאי הצמיחה שלנו (איורים 2b, 6a).במקביל, בדקנו נגזרות של חומצה אורמוטונית ובחרנו כמה מהן שבריכוזים מסוימים גרמו לצמיחת שורשים אלכסונית.תרכובות 8, 9 ו-15 שינו את כיוון צמיחת השורשים ב-75 מיקרומטר, 50 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר, בהתאמה, מה שמצביע על כך שתרכובות אלה יכולות לערער את היציבות במיקרוטובוליות (איור 2b, 6a).בדקנו גם את נגזרת החומצה האורסולית החזקה ביותר, KAND 11, בריכוז נמוך יותר (15 µM) ומצאנו שיישום של KAND 11 עיכב את צמיחת השורשים וכי כיוון צמיחת השורשים היה לא אחיד, למרות שהם נטו לשיפוע שמאלה ( איור ג3)..מכיוון שריכוזים גבוהים יותר של תרופות מערערות מיקרו-צינוריות מעכבות לפעמים את צמיחת הצמח במקום לגרום להטיית שורש, הערכנו לאחר מכן את האפשרות ש-KAND 11 משפיע על מיקרו-צינוריות על-ידי התבוננות במיקרו-טובוליות בקליפת המוח בתאי אפידרמיס שורש.אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים אנטי-β-טובולין בתאי אפידרמיס של שורשי שתיל שטופלו ב-25 מיקרומטר KAND 11 הראתה את היעלמותם של כמעט כל המיקרוטובולים הקורטיקליים בתאי האפידרמיס באזור ההתארכות (איור 6b).תוצאות אלו מצביעות על כך שחומצה קוממוטונית ונגזרותיה פועלות במישרין או בעקיפין על המיקרוטובוליות כדי לשבש אותן וכי תרכובות אלו הן מעכבי מיקרוטובוליים חדשים.
חומצה אורסונית ונגזרותיה משנות את המיקרוטובוליות בקליפת המוח ב- Arabidopsis thaliana.(א) זווית נטיית השורש נמדדת בנוכחות נגזרות שונות של חומצה אורמוטונית בריכוזים המצוינים.נותחו גם ההשפעות של שתי תרכובות הידועות כמעכבות מיקרוטובולים: דיסופרמיד ואוריזלין.התוספת מציגה את התקן המשמש למדידת זווית צמיחת שורשים.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בטיפול מדומה (מבחן t, עמ'< 0.05).n>19. פס קנה מידה = 1 ס"מ.(ב) מיקרוטובולים קורטיקליים בתאי אפידרמיס באזור ההתארכות.מיקרוטובולים בשורשי Arabidopsis Col מסוג פרא שגדלו על צלחות טרשת נפוצה עם או בלי 25 מיקרומטר KAND 11 הוצגו על ידי צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים ראשוניים של β-טובולין ונוגדנים משניים מצומדים אלכסה פלואור.סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.(ג) מבנה מיטוטי של מיקרוטובולים במריסטם השורש.מיקרוטובולים הוצגו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית.מבנים מיטוטיים, כולל אזורי פרופאזה, צירים ופרגמופלסטים, נספרו מתמונות קונפוקאליות.חיצים מצביעים על מבנים מיקרוטובוליים מיטוטיים.כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים בטיפול מדומה (מבחן t, עמ'< 0.05).n>9. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
למרות שלאורסה יש את היכולת לשבש את תפקוד המיקרוטובוליות, מנגנון הפעולה שלה צפוי להיות שונה מחומרי דה-פולימריזציה טיפוסיים של מיקרו-צינוריות.לדוגמה, ריכוזים גבוהים יותר של חומרי דה-פולימריזציה של מיקרו-צינוריות כגון דיספירמיד ואוריזלין גורמים להתרחבות אנזוטרופית של תאי האפידרמיס, בעוד ש-KAND 11 לא.בנוסף, יישום משותף של KAND 11 ודיסופירמיד הביא לתגובת צמיחת שורש משולבת המושרה על ידי דיסופרמיד ונצפה עיכוב צמיחה המושרה על ידי KAND 11 (איור S4).כמו כן, ניתחנו את התגובה של המוטאנט דיספירמיד 1-1 (phs1-1) בעל רגישות יתר ל-KAND 11. ל-phs1-1 יש מוטציה לא-קנונית של נקודת טובולין קינאז, והוא מייצר שורשים קצרים יותר כאשר מטופלים ב-disopyramide9,20.לשתילים מוטנטיים phs1-1 שגדלו על מדיום אגר המכיל KAND 11 שורשים קצרים יותר דומים לאלה שגדלו על דיספירמידה (איור S5).
בנוסף, צפינו במבנים מיקרוטובוליים מיטוטיים, כגון אזורי פרופאזה, צירים ופרגמופלסטים, במריסטם השורש של שתילים שטופלו ב-KAND 11. בהתאם לתצפיות עבור CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, ירידה משמעותית ב נצפה מספר המיקרוטובולים המיטוטיים (איור .6c).
כדי לאפיין את הציטוטוקסיות של KAND 11 ברזולוציה תת-תאית, טיפלנו בתאי תרחיף BY-2 של טבק עם KAND 11 וצפינו בתגובתם.תחילה הוספנו KAND 11 לתאי BY-2 המבטאים TagRFP-TUA6, המסמן מיקרוטובוליות פלואורסצנטית, כדי להעריך את ההשפעה של KAND 11 על מיקרוטובולים בקליפת המוח.צפיפות המיקרו-צינוריות בקליפת המוח הוערכה באמצעות ניתוח תמונה, אשר כימת את אחוז הפיקסלים הציטו-שלד בין פיקסלים ציטופלזמיים.תוצאות הבדיקה הראו כי לאחר טיפול ב-50 μM או 100 μM KAND 11 למשך שעה, הצפיפות ירדה באופן משמעותי ל-0.94 ± 0.74% או 0.23 ± 0.28%, בהתאמה, בעוד שצפיפות התאים שטופלו ב-DMSO , הסתכמה ב- 34 ± 10 . % (איור 7א).תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם התצפית בארבידופסיס שטיפול ב-KAND 11 גורם לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים בקליפת המוח (איור 6b).כמו כן, בחנו את קו BY-2 עם חוטי אקטין המסומנים ב-GFP-ABD לאחר טיפול באותו ריכוז של KAND 11 וראינו שטיפול ב-KAND 11 שיבש את חוטי האקטין.טיפול ב-50 μM או 100 μM KAND 11 למשך שעה אחת הפחית משמעותית את צפיפות חוטי האקטין ל-1.20 ± 0.62% או 0.61 ± 0.26%, בהתאמה, בעוד שהצפיפות בתאים שטופלו ב-DMSO הייתה 1.69 ± 0.69%.7ב).תוצאות אלו מנוגדות להשפעות של propyzamide, שאינו משפיע על חוטי האקטין, ושל latrunculin B, דה-פולימריזר של אקטין שאינו משפיע על מיקרוטובולים (SI איור S6).בנוסף, טיפול בקומאמונאמיד 1, חומצה קוממונאמיד 6 או KAND 11 לא השפיע על מיקרוטובולים בתאי HeLa (איור SI S7).לפיכך, מאמינים שמנגנון הפעולה של KAND 11 שונה מזה של משבשי שלד ציטוניים ידועים.בנוסף, התצפית המיקרוסקופית שלנו בתאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 חשפה את תחילתו של מוות תאים במהלך טיפול ב-KAND 11 והראתה ששיעור התאים המתים המוכתמים ב-Evans לא עלה באופן משמעותי לאחר 30 דקות של טיפול ב-KAND 11, בעוד לאחר 90 דקות של טיפול ב-50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר KAND, מספר התאים המתים עלה ל-43.7% או 80.1%, בהתאמה (איור 7c).יחד, נתונים אלו מצביעים על כך שנגזרת החומצה האורסולית החדשה KAND 11 היא מעכב ציטושלד ספציפי לצמח עם מנגנון פעולה שלא היה ידוע קודם לכן.
KAND משפיע על מיקרו-צינוריות קליפת המוח, חוטי אקטין, ועל הכדאיות של תאי BY-2 של טבק.(א) הדמיה של microtubules קליפת המוח בתאי BY-2 בנוכחות TagRFP-TUA6.תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) או DMSO נבדקו במיקרוסקופיה קונפוקלית.צפיפות המיקרו-צינוריות בקליפת המוח חושבה מצילומי מיקרו של 25 תאים עצמאיים.אותיות מצביעות על הבדלים משמעותיים (בדיקת Tukey HSD, עמ'< 0.05).סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.(ב) חוטי אקטין בקליפת המוח בתאי BY-2 המוצגים בנוכחות GFP-ABD2.תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) או DMSO נבדקו במיקרוסקופיה קונפוקלית.הצפיפות של חוטי אקטין בקליפת המוח חושבה מצילומי מיקרו של 25 תאים עצמאיים.אותיות מצביעות על הבדלים משמעותיים (בדיקת Tukey HSD, עמ'< 0.05).סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר.(ג) תצפית בתאי BY-2 מתים על ידי צביעה כחולה של אוונס.תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) או DMSO נבדקו במיקרוסקופיה של שדה בהיר.n=3.סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
הגילוי והיישום של מוצרים טבעיים חדשים הובילו להתקדמות משמעותית בהיבטים שונים של חיי האדם, לרבות רפואה וחקלאות.מחקר היסטורי בוצע כדי להשיג תרכובות שימושיות ממשאבי טבע.בפרט, ידועים כי אקטינומיציטים שימושיים כאנטיביוטיקה אנטי-טפילית לנמטודות בשל יכולתם לייצר מטבוליטים משניים שונים כגון אוורמקטין, התרכובת המובילה של איברמקטין ובלומיצין ונגזרותיו, המשמשת רפואית כחומר אנטי סרטני21,22.כמו כן, התגלו מגוון תרכובות קוטלי עשבים מאקטינומיציטים, חלקם כבר בשימוש מסחרי1,23.לכן, הניתוח של מטבוליטים של אקטינומיציטים כדי לבודד מוצרים טבעיים עם פעילויות ביולוגיות רצויות נחשב לאסטרטגיה יעילה.במחקר זה, גילינו תרכובת חדשה, קוממונאמיד, מ-S. werraensis וסינתזנו אותה בהצלחה.חומצה אורסונית היא תוצר ביניים סינטטי של אורבנאמיד ונגזרותיו.זה יכול לגרום לסלסול שורשים אופייני, להפגין פעילות קוטל עשבים בינונית עד חזקה, ולפגוע במישרין או בעקיפין במיקרוטובולים של הצמח.עם זאת, מנגנון הפעולה של חומצה אורמוטונית עשוי להיות שונה מזה של מעכבי מיקרוטובולה קיימים, שכן KAND 11 משבש גם חוטי אקטין וגורם למוות של תאים, דבר המצביע על מנגנון רגולטורי שבאמצעותו חומצה אורמוטונית ונגזרותיה משפיעות על מגוון רחב של מבנים ציטו-שלד..
אפיון מפורט נוסף של חומצה אורבנונית יעזור להבין טוב יותר את מנגנון הפעולה של חומצה אורבנונית.בפרט, המטרה הבאה היא להעריך את יכולתה של חומצה אורסונית להיקשר למיקרוטובוליות מופחתות כדי לקבוע האם החומצה האורסונית ונגזרותיה פועלות ישירות על המיקרוטובוליות ומפרקות אותן, או שמא פעולתן גורמת לחוסר יציבות במיקרוטובוליות.בנוסף, במקרה בו המיקרוטובולים אינם מטרה ישירה, זיהוי אתר הפעולה והמטרות המולקולריות של חומצה אורסונית על תאי הצמח יסייעו בהבנה נוספת של התכונות של תרכובות קשורות ודרכים אפשריות לשיפור פעילות קוטל עשבים.מבחן הפעילות הביולוגית שלנו חשף את היכולת הציטוטוקסית הייחודית של חומצה אורסונית על צמיחתם של צמחים כגון Arabidopsis thaliana, טבק ותאי כבד, בעוד שלא תאי E. coli או HeLa נפגעו.רעילות קטנה או ללא רעילות לתאי בעלי חיים היא יתרון של נגזרות של חומצה אורסונית אם הן מפותחות כקוטלי עשבים לשימוש בשדות חקלאיים פתוחים.ואכן, מכיוון שמיקרוטובולים הם מבנים נפוצים באוקריוטים, העיכוב הסלקטיבי שלהם בצמחים הוא דרישת מפתח לקוטלי עשבים.לדוגמה, propyzamide, חומר דה-פולימריזציה של מיקרו-צינוריות הנקשר ישירות לטובולין ומעכב פילמור, משמש כקוטל עשבים בשל הרעילות הנמוכה שלו לתאי בעלי חיים24.בניגוד לדיסופירמיד, לבנזאמידים קשורים יש סגוליות מטרה שונות.בנוסף למיקרו-צינוריות צמחיות, RH-4032 או benzoxamide גם מעכבים מיקרו-צינוריות של תאי בעלי-חיים או אומיציטים, בהתאמה, ו-zalilamide משמש כקוטל פטריות בשל הפיטוטוקסיות הנמוכה שלו25,26,27.הדוב החדש שהתגלה ונגזרותיו מפגינים ציטוטוקסיות סלקטיבית כנגד צמחים, אך ראוי לציין ששינויים נוספים עשויים לשנות את סגוליות המטרה שלהם, ועלולים לספק נגזרות נוספות לבקרת פטריות פתוגניות או oomycetes.
התכונות הייחודיות של חומצה אורבנונית ונגזרותיה מועילות לפיתוחן כקוטלי עשבים ולשימוש ככלי מחקר.חשיבותו של שלד הציטוס בשליטה על צורת תא הצמח מוכרת ברבים.מחקרים מוקדמים יותר הראו שצמחים פיתחו מנגנונים מורכבים של ארגון מיקרו-צינוריות בקליפת המוח על-ידי שליטה בדינמיקה של מיקרו-טובוליות כדי לשלוט כראוי במורפוגנזה.זוהו מספר רב של מולקולות האחראיות לוויסות פעילות המיקרוטובוליות, ומחקר קשור עדיין נמשך3,4,28.ההבנה הנוכחית שלנו של דינמיקה של מיקרו-צינוריות בתאי צמחים אינה מסבירה במלואה את המנגנונים של ארגון מיקרו-צינוריות בקליפת המוח.לדוגמא, למרות שגם דיספירמיד וגם אוריזלין יכולים לעשות דה-פולימריזציה של מיקרוטובולים, דיספירמיד גורם לעיוות שורש חמור בעוד שלאוריזלין יש השפעה מתונה יחסית.יתרה מכך, מוטציות בטובולין, המייצבות את המיקרוטובוליות, גורמות גם הן לדקסטרורוטציה בשורשים, בעוד ש-paclitaxel, המייצב גם את דינמיקת המיקרוטובוליות, לא.לכן, לימוד וזיהוי המטרות המולקולריות של חומצה אורסולית אמורים לספק תובנות חדשות לגבי ויסות המיקרו-צינוריות הצמחיות בקליפת המוח.כמו כן, השוואות עתידיות של כימיקלים יעילים בקידום גדילה מעוותת, כגון דיסופירמיד, וכימיקלים פחות יעילים, כגון אוריזלין או חומצה קוממוטורית, יספקו רמזים כיצד מתרחשת צמיחה מעוותת.
מצד שני, סידורים ציטו-שלד הקשורים להגנה הם אפשרות נוספת להסביר את הציטוטוקסיות של חומצה אורסונית.הדבקה של פתוגן או החדרה של מעורר לתאי צמחים גורמים לפעמים להרס של שלד הציטוס ולמוות תאי שלאחר מכן29.לדוגמה, קריפטוקסנטין שמקורו באומיציטים דווח כמשבש מיקרוטובולים וחוטי אקטין לפני מוות של תאי טבק, בדומה למה שמתרחש בטיפול ב-KAND30,31.הדמיון בין תגובות הגנה לתגובות תאי המושרה על ידי חומצה אורסונית הוביל אותנו לשער שהן מעוררות תהליכים תאיים נפוצים, אם כי ניכרת השפעה מהירה וחזקה יותר של חומצה אורסונית מאשר קריפטוקסנטין.עם זאת, מחקרים הראו ששיבושים בחוטי האקטין מעודדים מוות תאים ספונטני, שלא תמיד מלווה בהפרעה במיקרוטובוליות29.בנוסף, נותר לראות אם הפתוגן או המעורר גורמים לצמיחת שורשים מעוותת, כפי שעושים נגזרות של חומצה אורסונית.לפיכך, ידע מולקולרי המקשר בין תגובות הגנה לבין שלד הציטוס הוא בעיה אטרקטיבית שיש לטפל בה.על ידי ניצול נוכחות של תרכובות במשקל מולקולרי נמוך הקשורות לחומצה אורסונית, כמו גם מגוון של נגזרות בעלות עוצמה משתנה, הן עשויות לספק הזדמנויות להתמקד במנגנונים תאיים לא ידועים.
ביחד, הגילוי והיישום של תרכובות חדשות המווסתות דינמיקה של מיקרוטובוליות יספקו שיטות רבות עוצמה לטיפול במנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס קביעת צורת התא הצמחי.בהקשר זה, התרכובת החומצה האורמוטונית שפותחה לאחרונה, המשפיעה על מיקרוטובוליות וחוטי אקטין ומעוררת מוות של תאים, עשויה לספק הזדמנות לפענח את הקשר בין בקרת מיקרוטובוליות למנגנונים אחרים אלה.לפיכך, ניתוח כימי וביולוגי באמצעות חומצה אורבנונית יעזור לנו להבין את מנגנוני הוויסות המולקולריים השולטים על שלד הציטוס של הצמח.
לחסן את S. werraensis MK493-CF1 לתוך בקבוק של 500 מ"ל ארלנמייר מבולבל המכילה 110 מ"ל של מדיום זרעים המורכב מ-2% (w/v) גלקטוז, 2% (w/v) משחת Essence, 1% (w/v) הרכב Bacto .-סוטון (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) תמצית תירס (KOGOSTCH Co., Ltd., Ltd., יפן), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ו-0.2% CaCO3 במים מפושטים.(pH 7.4 לפני עיקור).תרביות הזרע הודגרו על שייקר סיבובי (180 סל"ד) ב-27 מעלות צלזיוס למשך יומיים.גידול ייצור באמצעות תסיסה במצב מוצק.תרבית הזרע (7 מ"ל) הועברה לבקבוק של 500 מ"ל K-1 המכילה 40 גרם מדיום ייצור המורכב מ-15 גרם שעורה דחוסה (MUSO Co., Ltd., יפן) ו-25 גרם מים מפושטים (pH לא מותאם לפני עיקור).).התסיסה בוצעה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך במשך 14 ימים.חומר התסיסה חולץ עם 40 מ"ל/בקבוק EtOH וצנטריפוגה (1500 גרם, 4 מעלות צלזיוס, 10 דקות).סופרנטנט התרבות (60 מ"ל) חולץ עם תערובת של 10% MeOH/EtOAc.השכבה האורגנית התאודה בלחץ מופחת לקבלת שארית (59.5 מ"ג), שעברה HPLC עם פליטת שיפוע (0-10 דקות: 90%) על עמודת פאזה הפוכה (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 מיקרומטר, ID 10 מ"מ × אורך 250 מ"מ) H2O/CH3CN, 10-35 דקות: 90% H2O/CH3CN עד 70% H2O/CH3CN (שיפוע), 35-45 דקות: 90% H2O/EtOH, 45-155 דקות: 90% H2O /EtOH ל-100% EtOH (שיפוע (שיפוע), 155-200 דקות: 100% EtOH) בקצב זרימה של 1.5 מ"ל לדקה, קוממונאמיד (1, 36.0 מ"ג) בודד כאבקה אמורפית לבנה.
קוממוטואמיד(1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 מגה-הרץ, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ערך מחושב: 141.0659, ערך נמדד: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1573 ס"מ.
זרעי קולומביה (Col-0) התקבלו ממרכז המשאבים הביולוגיים של ארבידופסיס (ABRC) עם אישור לשימוש מחקר.זרעי Col-0 הופצו ונשמרו בתנאי המעבדה שלנו ושימשו כצמחי ארבידופסיס מסוג בר.זרעי ארבידופסיס עברו עיקור משטח ותופחו במדיום חצי חוזק Murashige ו-Skoog המכיל 2% סוכרוז (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) חומצה 2-(4-מורפולינו) אתאן-סולפוני (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ).) ו-1.5% אגר (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, ב-23 מעלות צלזיוס ובאור קבוע.זרעים של המוטנט phs1-1 סופקו על ידי T. Hashimoto (מכון נארה למדע וטכנולוגיה).
זרעים של זן SR-1 סופקו על ידי T. Hashimoto (מכון נארה למדע וטכנולוגיה) ושימשו כצמחי טבק מסוג בר.זרעי טבק עוקרו על פני השטח והושרו במים סטריליים למשך שלושה לילות כדי לקדם נביטה, ולאחר מכן הוכנסו לתמיסת חצי חוזק המכילה 2% סוכרוז, 0.05% (w/v) MES ו-0.8% ג'לן מסטיק (Fujifilm Wako Pure Chemical) מוראשיג'.ומדיום Skoog) עם pH 5.7 ומודגרים ב-23 מעלות צלזיוס באור קבוע.
זן Tak-1 סופק על ידי T. Kohchi (אוניברסיטת קיוטו) ושימש כיחידת הניסוי הסטנדרטית עבור מחקר הכבד.ג'מה הושגה מצמחים מתורבתים מעוקרים ולאחר מכן מצופה על מדיום Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) המכיל 1% סוכרוז ו-0.3% ג'לן מסטיק והודגר ב-23 מעלות צלזיוס באור מתמשך.
תאי טבק BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) סופקו על ידי S. Hasezawa (אוניברסיטת טוקיו).תאי BY-2 הודללו פי 95 במדיום שונה של Linsmeier ו-Skoog והוספו מדי שבוע עם חומצה 2,4-dichlorophenoxyacetic 32.תרחיף התאים היה מעורב על שייקר סיבובי ב-130 סל"ד ב-27 מעלות צלזיוס בחושך.שטפו את התאים בנפח פי 10 של מדיום טרי והשעלו מחדש באותו המדיום.קווי תאים מהונדסים BY-2 המבטאים באופן יציב את סמן המיקרוטובוליות TagRFP-TUA6 או את סמן חוט האקטין GFP-ABD2 תחת פרוטור 35S של וירוס פסיפס כרובית נוצרו כמתואר33,34,35.קווי תאים אלה יכולים להישמר ולסנכרן באמצעות נהלים דומים לאלה המשמשים עבור קו התא המקורי BY-2.
תאי HeLa תורבו במדיום של Dulbecco שונה של Eagle's (DMEM) (Life Technologies) בתוספת של 10% סרום בקר עוברי, 1.2 U/ml פניצילין ו-1.2 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו בהתאם לתקנות ולהנחיות הבטיחות הביולוגית היפנית.
תרכובות הומסו ב-dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) כתמיסות מניות ודוללו במדיום MS עבור Arabidopsis וטבק או מדיום Gamborg B5 עבור תועלת כבד.עבור בדיקת עיכוב צמיחת השורשים, יותר מ-10 זרעים לצלחת נזרעו על מדיום אגר המכיל את התרכובות המצוינות או DMSO.זרעים הודגרו בתא גידול למשך 7 ימים.השתילים צולמו ונמדד אורך השורשים.עבור בדיקת נביטה של ארבידופסיס, 48 זרעים לצלחת נזרעו על מדיום אגר המכיל 200 מיקרומטר תרכובת או DMSO.זרעי ארבידופסיס גודלו בתא גידול ומספר השתילים המונבטים נספר 7 ימים לאחר הנביטה (dag).עבור בדיקת נביטת טבק, 24 זרעים לצלחת נזרעו על מדיום אגר המכיל 200 מיקרומטר KAND או DMSO.זרעי טבק גודלו בתא גידול ומספר השתילים המונבטים נספר לאחר 14 ימים.עבור בדיקת עיכוב צמיחת הכבד, 9 עוברים מכל צלחת צופו על מדיום אגר המכיל את הריכוזים המצוינים של KAND או DMSO והודגרו בתא גידול למשך 14 ימים.
השתמש בשתילים מוכתמים ב-5 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד (PI) כדי להמחיש את ארגון המריסטם השורשי.אותות PI נצפו במיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקאלי TCS SPE (Leica Microsystems).
צביעה היסטוכימית של שורשים עם β-glucuronidase (GUS) בוצעה על פי הפרוטוקול שתואר על ידי מלאמי ובנפיי36.שתילים נקבעו ב-90% אצטון למשך הלילה, נצבעו ב-0.5 מ"ג/מ"ל 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-d-glucuronic חומצה במאגר GUS למשך שעה אחת והונחו בתמיסת כלורלדהיד מיובשת.(8 גרם כלורלי הידרט, 2 מ"ל מים ו-1 מ"ל גליצרול) ונצפה על ידי מיקרוסקופ ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות באמצעות מיקרוסקופ Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
זוויות שורש נמדדו על שתילים בני 7 ימים שגדלו על צלחות המונחות אנכית.מדוד את זווית השורש מכיוון וקטור הכבידה כמתואר בשלב 6.
סידור המיקרוטובולים בקליפת המוח נצפה כמתואר, עם שינויים קלים בפרוטוקול 37.נוגדנים אנטי-β-טובולין (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ו-Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) שימשו כנוגדנים ראשוניים ומשניים בדילול 1:1000 ו-1:100, בהתאמה.תמונות פלואורסצנטיות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקאלי TCS SPE (Leica Microsystems).רכוש תמונות מחסנית Z וצור הקרנות בעוצמה מרבית בהתאם להוראות היצרן.
בדיקת התפשטות תאי HeLa בוצעה באמצעות ערכת ספירת תאים 8 (Dojindo) לפי הוראות היצרן.
הצמיחה של E. coli DH5α נותחה על ידי מדידת צפיפות תאים בתרבית באמצעות ספקטרופוטומטר ב-600 ננומטר (OD600).
ארגון ציטו-שלד בתאי BY-2 מהונדסים נצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במכשיר סריקה קונפוקאלי CSU-X1 (Yokogawa) ומצלמת sCMOS (Zyla, Andor Technology).צפיפות ציטו-שלד הוערכה על ידי ניתוח תמונה, אשר כימת את אחוז הפיקסלים הציטו-שלד בין פיקסלים ציטופלזמיים בתמונות קונפוקאליות באמצעות תוכנת ImageJ כמתואר38,39.
כדי לזהות מוות של תאים בתאי BY-2, מנה של תרחיף התאים הודגרה עם 0.05% אוונס כחול למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.צביעה כחולה סלקטיבית של אוונס של תאים מתים תלויה בשיחול של הצבע מתאי קיימא על ידי קרום הפלזמה השלם40.תאים מוכתמים נצפו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (BX53, Olympus).
תאי HeLa גודלו ב-DMEM בתוספת של 10% FBS באינקובטור לחות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2.תאים טופלו ב-100 מיקרומטר KAND 11, חומצה קוממונאמית 6, קוממונאמיד 1, 100 ננוגרם/מ"ל קולקמיד (Gibco), או 100 ננומטר למ"ל Nocodmaze (Sigma) במשך 6 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.תאים נקבעו עם MetOH למשך 10 דקות ולאחר מכן עם אצטט למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.תאים קבועים הודגרו עם נוגדן ראשוני β-טובולין (1D4A4, Proteintech: 66240-1) מדולל ב-0.5% BSA/PBS למשך שעתיים, נשטף 3 פעמים עם TBST, ולאחר מכן הודגרה עם נוגדן עיזים Alexa Fluor.488 שעה אחת.– IgG של עכבר (Thermo Fisher Scientific: A11001) ו-15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל ב-0.5% BSA/PBS.לאחר שטיפה עם TBST שלוש פעמים, נצפו תאים מוכתמים במיקרוסקופ הפוך של Nikon Eclipse Ti-E.התמונות צולמו במצלמת Hamamatsu ORCA-R2 CCD מקוררת באמצעות תוכנת MetaMorph (Molecular Devices).
זמן פרסום: 17 ביוני 2024