גילוי, אפיון ושיפור תפקודי של מונואמידים של דובה כמעכבי צמיחת צמחים חדשים המשפיעים על מיקרוטובולים של צמחים.

תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים תמכה ב-CSS באופן מוגבל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן שלכם (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא עיצוב או JavaScript.
גילוי ושימוש מועיל במוצרים טבעיים יכולים לסייע בשיפור חיי האדם. כימיקלים מעכבי צמיחת צמחים נמצאים בשימוש נרחב כקוטלי עשבים לשליטה בעשבים שוטים. עקב הצורך להשתמש בסוגים שונים של קוטלי עשבים, קיים צורך לזהות תרכובות בעלות מנגנוני פעולה חדשים. במחקר זה, גילינו תרכובת N-אלקוקסיפירול חדשה, קוממונאמיד, מ-Streptomyces werraensis MK493-CF1 וביססנו את תהליך הסינתזה המלא. באמצעות מבחני פעילות ביולוגית, גילינו שחומצה אורס-מונואמית היא תוצר ביניים סינתטי של אורס-מונואמית ופוטנציאל...מעכב צמיחת צמחיםבנוסף, פיתחנו נגזרות שונות של חומצה אורבנונית, כולל נגזרת האורבנילוקסי (UDA), בעלת פעילות קוטלת עשבים גבוהה מבלי להשפיע לרעה על צמיחת תאי HeLa. כמו כן, מצאנו כי נגזרות חומצה אורמוטונית משבשות את המיקרוטובולים בצמחים; בנוסף, KAND משפיע על סיבי אקטין וגורם למוות תאי; השפעות רב-גוניות אלו שונות מאלה של מעכבי מיקרוטובולים ידועים ומצביעות על מנגנון פעולה חדש עבור חומצה אורסונית, המייצג יתרון חשוב בפיתוח קוטלי עשבים חדשים.
הגילוי והיישום המעשי של מוצרים טבעיים מועילים ונגזרותיהם הם אמצעי לשיפור איכות חיי האדם. מטבוליטים משניים המיוצרים על ידי מיקרואורגניזמים, צמחים וחרקים הובילו להתקדמות משמעותית ברפואה ובחקלאות. אנטיביוטיקה ותרופות רבות נגד לוקמיה פותחו ממוצרים טבעיים. בנוסף, סוגים שונים שלחומרי הדברה, קוטלי פטריות וקוטלי עשבים מופקים ממוצרים טבעיים אלה לשימוש בחקלאות. בפרט, קוטלי עשבים להדברת עשבים שוטים הם כלים חשובים להגדלת יבולי גידולים בחקלאות המודרנית, וסוגים שונים של תרכובות כבר נמצאים בשימוש מסחרי. מספר תהליכים תאיים בצמחים, כגון פוטוסינתזה, מטבוליזם של חומצות אמינו, סינתזת דופן התא, ויסות מיטוזה, איתות פיטוהורמונים או סינתזת חלבונים, נחשבים למטרות אופייניות של קוטלי עשבים. תרכובות המעכבות את תפקוד המיקרוטובולים הן סוג נפוץ של קוטלי עשבים המשפיעים על צמיחת צמחים על ידי השפעה על ויסות המיטוזיס.
מיקרוטובולים הם מרכיבים של שלד התא והם נשמרים באופן נרחב בתאים אאוקריוטיים. ההטרודימר של טובולין מורכב מ-α-טובולין ו-β-טובולין ויוצרים פרוטופילמנטים ליניאריים של מיקרוטובולים, כאשר 13 פרוטופילמנטים יוצרים מבנה גלילי. מיקרוטובולים ממלאים תפקידים מרובים בתאי צמחים, כולל קביעת צורת התא, חלוקת התא והובלה תוך תאית3,4. תאי צמח מכילים מיקרוטובולים מתחת לקרום הפלזמה הבין-פאזי, ומיקרוטובולים קורטיקליים אלה נחשבים כשולטים בארגון המיקרופיברילים של תאית באמצעות ויסות קומפלקסים של סינתאז תאית4,5. מיקרוטובולים קורטיקליים של תאי אפידרמיס של השורש, הנמצאים באזור ההתארכות המהירה של קצה השורש, ממוקמים לרוחב, ומיקרוסיבי תאית עוקבים אחר המיקרוטובולים הללו ומגבילים את כיוון התפשטות התא, ובכך מקדמים התארכות תאים אניזוטרופית. לכן, תפקוד המיקרוטובולים קשור קשר הדוק למורפולוגיה של הצמח. החלפות חומצות אמינו בגנים המקודדים טובולין גורמות להטיה של מערכי מיקרוטובולים קורטיקליים ולצמיחה בצד שמאל או ימין בארבידופסיס 6,7. באופן דומה, מוטציות בחלבונים הקשורים למיקרוטובולים המווסתים את הדינמיקה של המיקרוטובולים יכולות גם להוביל לצמיחת שורשים מעוותת 8,9,10,11,12,13. בנוסף, טיפול בקוטלי עשבים משבשים מיקרוטובולים כגון דיסופירמיד, הידוע גם בשם פרטילכלור, גורם גם לצמיחת שורשים אלכסונית בצד שמאל 14. נתונים אלה מצביעים על כך שוויסות מדויק של תפקוד המיקרוטובולים הוא קריטי לקביעת כיוון צמיחת הצמח.
התגלו סוגים שונים של מעכבי מיקרוטובולים, ותרופות אלו תרמו תרומה משמעותית למחקר ציטוסקלטלי, כמו גם לחקלאות ולרפואה2. בפרט, אוריזלין, תרכובות דיניטרואנילין, דיסופירמיד, תרכובות קשורות לבנזמיד, והאנלוגים שלהן יכולים לעכב את תפקוד המיקרוטובולים ובכך לעכב את צמיחת הצמחים. לכן, הם נמצאים בשימוש נרחב כקוטלי עשבים. עם זאת, מכיוון שמיקרוטובולים הם מרכיב חשוב בתאי צמחים ובעלי חיים, רוב מעכבי המיקרוטובולים הם ציטוטוקסיים לשני סוגי התאים. לכן, למרות התועלת המוכרת שלהם כקוטלי עשבים, מספר מוגבל של חומרים אנטי-מיקרוטובולים משמשים למטרות מעשיות.
סטרפטומיצס הוא סוג ממשפחת הסטרפטומיצס, הכולל חיידקים אירוביים, גרם-חיוביים, פילמנטיים, והוא ידוע ביכולתו לייצר מגוון רחב של מטבוליטים משניים. לכן, הוא נחשב לאחד המקורות החשובים ביותר לתוצרים טבעיים חדשים הפעילים ביולוגית. במחקר הנוכחי, גילינו תרכובת חדשה בשם קוממונאמיד, שבודדה מסטרפטומיצס werraensis MK493-CF1 ומ-S. werraensis ISP 5486. באמצעות ניתוח ספקטרלי וניתוח ספקטרלי מלא, אופיין מבנה הקוממונאמיד ונקבע שלד ה-N-אלקוקסיפירול הייחודי שלו. נמצא כי חומצה אורסונית, תוצר ביניים סינתטי של אורמונואמיד ונגזרותיה, מעכב את הצמיחה והנביטה של ​​צמח המודל הפופולרי Arabidopsis thaliana. במחקר יחסי מבנה-פעילות, מצאנו כי תרכובת עם C9 שעברה שינוי לחומצה אורסונית, הנקראת נגזרת נונילוקסי של חומצה אורסונית (KAND), משפרת משמעותית את ההשפעה המעכבת על צמיחה ונביטה. ראוי לציין כי מעכב צמיחת הצמחים החדש שהתגלה השפיע גם על צמיחת הטבק ועשב הכבד ולא היה ציטוטוקסי לחיידקים או לתאי HeLa. יתר על כן, חלק מנגזרות החומצה האורמוטונית גורמות לפנוטיפ שורש מעוות, מה שמרמז שנגזרות אלו משפיעות באופן ישיר או עקיף על המיקרוטובולים. בהתאם לרעיון זה, התצפיות שלנו על מיקרוטובולים המסומנים באופן אימונוהיסטוכימי או עם חלבונים פלואורסצנטיים מצביעות על כך שטיפול ב-KAND גורם לדה-פולימריזציה של המיקרוטובולים. בנוסף, טיפול בנגזרות חומצה קומוטונית משבש את המיקרופילמנטים של האקטין. לפיכך, גילינו מעכב צמיחת צמחים חדש שמנגנון הפעולה הייחודי שלו כרוך בהרס שלד התא.
זן MK493-CF1 בודד מאדמה בשינאגאווה-קו, טוקיו. זן MK493-CF1 יצר תפטיר סטרומלי מסועף היטב. נקבע הרצף החלקי של גן ה-RNA הריבוזומלי 16S (1422 בסיסים). זן זה דומה מאוד ל-S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 בסיסים, T: זן טיפוסי, 99.93%). בהתבסס על תוצאה זו, נקבע כי זן זה קשור קשר הדוק לזן הטיפוסי של S. werraensis. לכן, קראנו לזן זה באופן זמני S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T מייצר גם הוא את אותן תרכובות ביו-אקטיביות. מאחר שלא היה מחקר מוקדם רב על קבלת מוצרים טבעיים ממיקרואורגניזם זה, נערך מחקר כימי נוסף. לאחר גידול של S. werraensis MK493-CF1 על מצע שעורה באמצעות תסיסה במצב מוצק ב-30 מעלות צלזיוס למשך 14 ימים, המצע חולץ עם 50% EtOH. 60 מ"ל מהדגימה יובשו לקבלת 59.5 מ"ג של תמצית גולמית. התמצית הגולמית עברה תהליך HPLC פאזה הפוכה לקבלת N-מתוקסי-1H-פירול-2-קרבוקסמיד (1, בשם קוממונאמיד, 36.0 מ"ג). הכמות הכוללת של 1 היא כ-60% מהתמצית הגולמית. לכן, החלטנו לחקור בפירוט את תכונותיו של קומאמונאמיד 1.
קוּמַמוֹנַמַאִיד 1 הוא אבקה אמורפית לבנה וספקטרומטריית מסות ברזולוציה גבוהה (HRESIMS) מאשרת את C6H8N2O2 (איור 1). קטע הפירול המוחלף ב-C2 של תרכובת זו מאופיין ב-δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 הרץ, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH בספקטרום 1H NMR: 4.5 הרץ, H-5) ו-δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 הרץ, H-6), וספקטרום 13C NMR מראה נוכחות של ארבעה אטומי פחמן sp2. נוכחות קבוצת אמיד בעמדה C2 הוערכה על ידי קורלציה HMBC מהפרוטון C-3 לפחמן קרבוניל אמיד ב-δC 161.1. בנוסף, פיקי NMR של 1H ו-13C ב-δH 4.10 (3H, S) ו-δC 68.3 מצביעים על נוכחות של קבוצות N-מתוקסי במולקולה. למרות שהמיקום הנכון של קבוצת המתוקסי טרם נקבע באמצעות ניתוח ספקטרוסקופי כגון ספקטרוסקופיית הפרשים משופרת וקיצור NOEDF (נוקלאי Overhauser), N-מתוקסי-1H-פירול-2-קרבוקסמיד הפך לתרכובת המועמדת הראשונה.
כדי לקבוע את המבנה הנכון של 1, בוצעה סינתזה מלאה (איור 2א). טיפול ב-2-אמינופירידין 2 הזמין מסחרית עם m-CPBA הביא לתחמוצת ה-N 3 המתאימה בתשואה כמותית. לאחר 2-אמינואזידציה של 2, תגובת הציקלוקונדנסציה שתוארה על ידי אברמוביץ' בוצעה בבנזן ב-90 מעלות צלזיוס כדי להשיג את 1-הידרוקסי-1H-פירול-2-קרבוניטריל 5 הרצוי בגרם. מהירות 60% (שני שלבים). 15,16. מתילציה והידרוליזה של 4 נתנו לאחר מכן חומצה 1-מתוקסי-1H-פירול-2-קרבוקסילית (המכונה "חומצה קומוטונית", 6) בתשואה טובה (70%, שני שלבים). לבסוף, אמידציה באמצעות תוצר ביניים חומצה כלורידית 6 באמצעות אמוניה מימית נתנה את אמיד קומאמוטו 1 בתשואה של 98%. כל הנתונים הספקטרליים של 1 המסונתז היו דומים ל-1 המבודד, ולכן נקבע המבנה של 1;
סינתזה כללית וניתוח של הפעילות הביולוגית של אורבנמיד וחומצה אורבנית. (א) סינתזה כוללת של אמיד קומאמוטו. (ב) שתילים של צמח בר מסוג Arabidopsis Columbia (Col) בני שבעה ימים גודלו על פלטות Murashige and Skoog (MS) המכילות קומאמונמיד 6 או קומאמונמיד 1 בריכוזים המצוינים. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ.
ראשית, הערכנו את הפעילות הביולוגית של אורבנמיד וחומרי הביניים שלו מבחינת יכולתם לווסת את צמיחת הצמח. הוספנו ריכוזים שונים של אורסמונמיד 1 או חומצה אורסונית 6 למדיום אגר MS וגידפנו שתילים של ארבידופסיס ת'ליאנה על מצע זה. ניסויים אלה הראו שריכוזים גבוהים (500 מיקרומולר) של 6 עיכבו את צמיחת השורשים (איור 2ב'). לאחר מכן, יצרנו נגזרות שונות על ידי החלפת עמדת N1 של 6 וביצענו עליהן מחקרי יחסי מבנה-פעילות (תהליך הסינתזה האנלוגית מתואר במידע התומך (SI)). שתילי ארבידופסיס גודלו על מצע המכיל 50 מיקרומולר נגזרות חומצה אורסונית, ואורך השורש נמדד כפי שמוצג בתמונה. כפי שמוצג באיורים 3א', ב' ו-S1, לחומצות קומאמו יש אורכים שונים של שרשראות אלקוקסי ליניאריות (9, 10, 11, 12 ו-13) או שרשראות אלקוקסי גדולות (15, 16 ו-17) בעמדת N1. הנגזרות הראו עיכוב משמעותי של צמיחת השורשים. בנוסף, מצאנו כי יישום של 200 מיקרומולר 10, 11 או 17 עיכב את הנביטה (איורים 3c ו-S2).
מחקר על קשר מבנה-פעילות של אמיד קומאמוטו ותרכובות קשורות. (א) סכמת מבנה וסינתזה של אנלוגים. (ב) כימות אורך השורש של שתילים בני 7 ימים שגודלו על מצע MS עם או בלי נגזרות קומאמונאמיד של 50 מיקרומולר. כוכביות מציינות הבדלים משמעותיים עם טיפול דמה (מבחן t, p< 0.05). n>18. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. nt פירושו "לא נבדק" מכיוון שיותר מ-50% מהזרעים לא נבטו. (ג) כימות שיעור הנביטה של ​​זרעים שטופלו שמודגרו במשך 7 ימים במדיום MS עם או בלי 200 מיקרומולר קומאמונאמיד ותרכובות קשורות. כוכביות מציינות הבדלים משמעותיים עם טיפול דמה (מבחן כי בריבוע). n=96.
מעניין לציין, כי הוספת שרשראות צד אלקיל ארוכות מ-C9 הפחיתה את הפעילות המעכבת, דבר המצביע על כך שתרכובות הקשורות לחומצה קומאמוטית דורשות שרשראות צד בגודל מסוים כדי להפגין את פעילותן הביולוגית.
מכיוון שניתוח יחסי מבנה-פעילות הראה ש-C9 עבר שינוי לחומצה אורסונית ונגזרת הנונילוקסי של חומצה אורסונית (להלן KAND 11) הייתה מעכב צמיחת הצמח היעיל ביותר, ערכנו אפיון מפורט יותר של KAND 11. טיפול בארבידופסיס עם 50 מיקרומולר KAND 11 מנע כמעט לחלוטין נביטה, בעוד שריכוזים נמוכים יותר (40, 30, 20 או 10 מיקרומולר) של KAND 11 עיכבו את צמיחת השורשים באופן תלוי מינון (איור 4א', ב'). כדי לבדוק האם KAND 11 משפיע על כדאיות מריסטמת השורש, בדקנו מריסטמות שורש שנצבעו בפרופידיום יודיד (PI) ומדדנו את גודל שטח המריסטם. גודל המריסטמה של שתילים שגודלו על מצע המכיל 25 מיקרומולר KAND-11 היה 151.1 ± 32.5 מיקרומטר, בעוד שגודל המריסטמה של שתילים שגודלו על מצע בקרה המכיל DMSO היה 264.7 ± 30.8 מיקרומטר (איור 4c, d), דבר המצביע על כך ש-KAND-11 משקם את הפעילות התאית. התפשטות. מריסטמת שורש. בהתאם לכך, טיפול ב-KAND 11 הפחית את כמות אות סמן חלוקת התאים CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS במריסטמת השורש (איור 4e)17. תוצאות אלו מצביעות על כך ש-KAND 11 מעכב את צמיחת השורשים על ידי הפחתת פעילות התפשטות התאים.
ניתוח ההשפעה המעכבת של נגזרות חומצה אורבנונית (נגזרות אורבנילוקסי) על צמיחה. (א) שתילים של צמח Col מסוג בר בני 7 ימים שגודלו על פלטות MS עם הריכוזים המצוינים של KAND 11. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (ב) כימות אורך השורש. אותיות מציינות הבדלים משמעותיים (מבחן Tukey HSD, p< 0.05). n>16. הנתונים מוצגים כממוצע ± סטיית תקן. (ג) מיקרוסקופיה קונפוקלית של שורשי Col מסוג בר צבועים בפרופידיום יודיד שגודלו על פלטות MS עם או בלי 25 מיקרומטר KAND 11. סוגריים לבנים מציינים את מריסטמת השורש. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ד) כימות גודל מריסטמת השורש (n = 10 עד 11). הבדלים סטטיסטיים נקבעו באמצעות מבחן t (p< 0.05). העמודות מייצגות את גודל המריסטם הממוצע. (ה) מיקרוסקופיית ניגודיות דיפרנציאלית (DIC) של מריסטם שורש המכילה את קונסטרקט CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS צבוע ונצבע על שתילים בני 5 ימים שגודלו על פלטות MS עם או בלי בדיקת KAND של 25 מיקרומטר.
הפיטוטוקסיות של KAND 11 נבדקה עוד יותר באמצעות צמח דו-פסיגי נוסף, טבק (Nicotiana tabacum), ואורגניזם מודל של צמח יבשה עיקרי, ירקן הכבד (Marchantia polymorpha). כמו במקרה של Arabidopsis, שתילי טבק SR-1 שגודלו על מצע המכיל 25 מיקרומולר KAND 11 ייצרו שורשים קצרים יותר (איור 5a). בנוסף, 40 מתוך 48 זרעים נבטו על לוחות המכילים 200 מיקרומולר KAND 11, בעוד שכל 48 הזרעים נבטו על מצע שטופל בדמה, דבר המצביע על כך שריכוזים גבוהים יותר של KAND היו משמעותיים (p< 0.05; מבחן chi -ריבוע) עיכב את נביטת הטבק. (איור 5b). בנוסף, ריכוז KAND 11 שעיכב את צמיחת החיידקים בכבד היה דומה לריכוז האפקטיבי בארבידופסיס (איור 5c). תוצאות אלו מצביעות על כך ש-KAND 11 יכול לעכב את צמיחתם של מגוון צמחים. לאחר מכן חקרנו את הציטוטוקסיות האפשרית של תרכובות הקשורות למונומיד דוב באורגניזמים אחרים, כלומר תאי HeLa אנושיים וזן Escherichia coli DH5α, כנציגים של תאים בעלי חיים ותאים חיידקיים גבוהים יותר, בהתאמה. בסדרה של מבחני התפשטות תאים, צפינו שקוממונאמיד 1, חומצה קוממונאמידית 6 ו-KAND 11 לא השפיעו על צמיחת תאי HeLa או E. coli בריכוזים של 100 מיקרומולר (איור 5d,e).
עיכוב גדילה של KAND 11 באורגניזמים שאינם ארבידופסיס. (א) שתילי טבק בר מסוג SR-1 בני שבועיים גודלו על פלטות MS הממוקמות אנכית המכילות 25 מיקרומטר KAND 11. (ב) שתילי טבק בר מסוג SR-1 בני שבועיים גודלו על פלטות MS הממוקמות אופקית המכילות 200 מיקרומטר KAND 11. (ג) ניצני כבד Tak-1 בני שבועיים שגודלו על פלטות Gamborg B5 עם הריכוזים המצוינים של KAND 11. חצים אדומים מצביעים על נבגים שהפסיקו לגדול בתוך תקופת הדגירה של שבועיים. (ד) בדיקת התפשטות תאים של תאי HeLa. מספר התאים החיים נמדד במרווחי זמן קבועים באמצעות ערכת ספירת תאים 8 (Dojindo). כביקורת, תאי HeLa טופלו ב-5 מיקרוגרם/מ"ל אקטינומיצין D (Act D), אשר מעכב שעתוק RNA פולימראז וגורם למוות תאי. הניתוחים בוצעו בשלושה עותקים. (ה) בדיקת התפשטות תאי E. coli. צמיחת E. coli נותחה על ידי מדידת OD600. כקבוצת ביקורת, התאים טופלו באמפיצילין (Amp) במינון 50 מיקרוגרם/מ"ל, אשר מעכב את סינתזת דופן התא של חיידקים. הניתוחים בוצעו בשלושה עותקים.
כדי לפענח את מנגנון הפעולה של ציטוטוקסיות הנגרמת על ידי תרכובות הקשורות לאורמיד, ניתחנו מחדש נגזרות חומצה אורבנית בעלות השפעות מעכבות מתונות, כפי שמוצג בתמונה. כפי שמוצג באיורים 2b, 6a, שתילים שגודלו על פלטות אגר המכילות ריכוזים גבוהים (200 מיקרומולר) של חומצה אורמוטונית 6 ייצרו שורשים קצרים יותר ומעוקלים שמאלה (θ = -23.7 ± 6.1), בעוד שבשתילים שגודלו על מצע הבקרה, השתילים ייצרו שורשים כמעט ישרים (θ = -3.8 ± 7.1). ידוע כי צמיחה אלכסונית אופיינית זו נובעת מתפקוד לקוי של מיקרוטובולים קורטיקליים 14,18. בהתאם לממצא זה, התרופות המערערות את היציבות של המיקרוטובולים דיסופירמיד ואוריזלין גרמו להטיית שורשים דומה בתנאי הגידול שלנו (איורים 2b, 6a). במקביל, בדקנו נגזרות חומצה אורמוטונית ובחרנו כמה מהן שבריכוזים מסוימים גרמו לצמיחה אלכסונית של שורשים. תרכובות 8, 9 ו-15 שינו את כיוון צמיחת השורשים ב-75 מיקרומולר, 50 מיקרומולר ו-40 מיקרומולר, בהתאמה, דבר המצביע על כך שתרכובות אלו יכולות לערער ביעילות את היציבות של המיקרוטובולים (איור 2ב', 6א'). בדקנו גם את נגזרת החומצה האורסולית החזקה ביותר, KAND 11, בריכוז נמוך יותר (15 מיקרומולר) ומצאנו כי יישום KAND 11 עיכב את צמיחת השורשים וכי כיוון צמיחת השורשים היה לא אחיד, למרות שהם נטו לנטות שמאלה (איור C3). מכיוון שריכוזים גבוהים יותר של תרופות המערערות את היציבות של המיקרוטובולים מעכבים לעיתים את צמיחת הצמח במקום לגרום להטיית השורש, הערכנו לאחר מכן את האפשרות ש-KAND 11 משפיע על המיקרוטובולים על ידי תצפית על מיקרוטובולים קורטיקליים בתאי אפידרמיס של השורש. אימונוהיסטוכימיה באמצעות נוגדנים אנטי-β-טובולין בתאי אפידרמיס של שורשי שתיל שטופלו ב-25 מיקרומולר KAND 11 הראתה את היעלמותן של כמעט כל המיקרוטובולים הקורטיקליים בתאי האפידרמיס באזור ההתארכות (איור 6ב'). תוצאות אלו מצביעות על כך שחומצה קומאטונית ונגזרותיה פועלות באופן ישיר או עקיף על מיקרוטובולים כדי לשבש אותן, וכי תרכובות אלו הן מעכבי מיקרוטובולים חדשים.
חומצה אורסונית ונגזרותיה משנים את המיקרוטובולים הקורטיקליים בארבידופסיס תליאנה. (א) זווית נטיית השורש נמדדה בנוכחות נגזרות שונות של חומצה אורמוטונית בריכוזים המצוינים. נותחו גם השפעותיהם של שני תרכובות הידועות כמעכבות מיקרוטובולים: דיסופירמיד ואוריזלין. התמונה המוקטנת מציגה את הסטנדרט המשמש למדידת זווית צמיחת השורש. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים עם טיפול דמה (מבחן t, p< 0.05). n>19. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (ב) מיקרוטובולים קורטיקליים בתאי אפידרמיס באזור ההתארכות. מיקרוטובולים בשורשי Arabidopsis Col מסוג בר שגודלו על פלטות MS עם או בלי 25 מיקרומטר KAND 11 נצפו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית באמצעות נוגדנים ראשוניים של β-טובולין ונוגדנים משניים מצומדים ל-Alexa Fluor. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) מבנה מיטוטי של מיקרוטובולים במריסטם השורש. מיקרוטובולים נצפו באמצעות צביעה אימונוהיסטוכימית. מבנים מיטוטיים, כולל אזורי פרופאזה, כישורים ופרגמופלסטים, נספרו מתמונות קונפוקליות. חצים מצביעים על מבני מיקרוטובולים מיטוטיים. כוכביות מצביעות על הבדלים משמעותיים עם טיפול דמה (מבחן t, p< 0.05). n>9. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
למרות של-Ursa יש את היכולת לשבש את תפקוד המיקרוטובולים, מנגנון הפעולה שלה צפוי להיות שונה מחומרים טיפוסיים לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים. לדוגמה, ריכוזים גבוהים יותר של חומרים לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים כמו דיסופירמיד ואוריזלין גורמים להתפשטות אניזוטרופית של תאי אפידרמיס, בעוד ש-KAND 11 לא עושה זאת. בנוסף, יישום משותף של KAND 11 ודיסופירמיד הביא לתגובת צמיחת שורשים משולבת המושרת על ידי דיסופירמיד ונצפה עיכוב צמיחה המושרה על ידי KAND 11 (איור S4). ניתחנו גם את תגובת המוטציה הרגישה יתר על המידה של דיסופירמיד 1-1 (phs1-1) ל-KAND 11. ל-phs1-1 יש מוטציה נקודתית לא קנונית של טובולין קינאז והוא מייצר שורשים קצרים יותר כאשר מטופל בדיסופירמיד9,20. שתילים של מוטנט phs1-1 שגודלו על מצע אגר המכיל KAND 11 היו בעלי שורשים קצרים יותר בדומה לאלה שגודלו על דיסופירמיד (איור S5).
בנוסף, צפינו במבנים מיקרוטובוליים מיטוטיים, כגון אזורי פרופאזה, כישורים ופרגמופלסטים, במריסטם השורש של שתילים שטופלו ב-KAND 11. בהתאם לתצפיות עבור CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, נצפתה ירידה משמעותית במספר המיקרוטובולים המיטוטיים (איור 6c).
כדי לאפיין את הציטוטוקסיות של KAND 11 ברזולוציה תת-תאית, טיפלנו בתאי BY-2 של טבק עם KAND 11 וצפינו בתגובתם. תחילה הוספנו KAND 11 לתאי BY-2 המבטאים TagRFP-TUA6, אשר מסמן מיקרוטובולים פלואורסצנטיים, כדי להעריך את השפעת KAND 11 על מיקרוטובולים קורטיקליים. צפיפות המיקרוטובולים קורטיקליים הוערכה באמצעות ניתוח תמונה, אשר כימת את אחוז הפיקסלים הציטו-שלדיים בקרב הפיקסלים הציטופלזמיים. תוצאות הבדיקה הראו שלאחר טיפול עם 50 מיקרומולר או 100 מיקרומולר KAND 11 למשך שעה, הצפיפות ירדה משמעותית ל-0.94 ± 0.74% או 0.23 ± 0.28%, בהתאמה, בעוד שצפיפות התאים שטופלו ב-DMSO הסתכמה ב-1.61 ± 0.34% (איור 7א'). תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם התצפית בארבידופסיס שטיפול ב-KAND 11 גורם לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים קורטיקליים (איור 6ב'). בדקנו גם את קו BY-2 עם סיבי אקטין המסומנים ב-GFP-ABD לאחר טיפול באותו ריכוז של KAND 11 וצפינו כי טיפול ב-KAND 11 שיבש את סיבי האקטין. טיפול ב-50 מיקרומולר או 100 מיקרומולר KAND 11 למשך שעה אחת הפחית משמעותית את צפיפות סיבי האקטין ל-1.20 ± 0.62% או 0.61 ± 0.26%, בהתאמה, בעוד שהצפיפות בתאים שטופלו ב-DMSO הייתה 1.69 ± 0.51% (איור 2). 7ב'). תוצאות אלו מנוגדות להשפעות של פרופיזמיד, שאינו משפיע על סיבי אקטין, ולטרונקולין B, חומר המפרק אקטין שאינו משפיע על מיקרוטובולים (איור SI S6). בנוסף, טיפול בקוממונאמיד 1, חומצה קוממונאמיד 6, או KAND 11 לא השפיע על מיקרוטובולים בתאי HeLa (איור SI S7). לפיכך, מנגנון הפעולה של KAND 11 נחשב שונה מזה של משבשי שלד התא. בנוסף, התצפית המיקרוסקופית שלנו בתאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 חשפה את תחילת מוות התאים במהלך טיפול ב-KAND 11 והראתה כי שיעור התאים המתים בצבע כחול אוונס לא גדל משמעותית לאחר 30 דקות של טיפול ב-KAND 11, בעוד שלאחר 90 דקות של טיפול ב-50 מיקרומולר או 100 מיקרומולר KAND, מספר התאים המתים גדל ל-43.7% או 80.1%, בהתאמה (איור 7c). יחד, נתונים אלה מצביעים על כך שנגזרת חומצה אורסולית חדשה, KAND 11, היא מעכבת שלד תאי ספציפית לצמח עם מנגנון פעולה לא ידוע קודם לכן.
KAND משפיע על מיקרוטובולים קורטיקליים, סיבי אקטין, וכדאיות של תאי BY-2 של טבק. (א) ויזואליזציה של מיקרוטובולים קורטיקליים בתאי BY-2 בנוכחות TagRFP-TUA6. תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומולר או 100 מיקרומולר) או DMSO נבדקו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. צפיפות המיקרוטובולים הקורטיקליים חושבה ממיקרוסקופים של 25 תאים בלתי תלויים. אותיות מציינות הבדלים משמעותיים (מבחן Tukey HSD, p< 0.05). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ב) סיבי אקטין קורטיקליים בתאי BY-2 שהוצגו בנוכחות GFP-ABD2. תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) או DMSO נבדקו באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית. צפיפות סיבי האקטין קורטיקליים חושבה ממיקרוסקופים של 25 תאים בלתי תלויים. אותיות מציינות הבדלים משמעותיים (מבחן Tukey HSD, p< 0.05). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (ג) תצפית על תאי BY-2 מתים על ידי צביעת כחול אוונס. תאי BY-2 שטופלו ב-KAND 11 (50 מיקרומטר או 100 מיקרומטר) או DMSO נבדקו על ידי מיקרוסקופיית שדה בהיר. n=3. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר.
גילוי ויישום של מוצרים טבעיים חדשים הובילו להתקדמות משמעותית בהיבטים שונים של חיי האדם, כולל רפואה וחקלאות. מחקרים היסטוריים נערכו כדי להשיג תרכובות שימושיות ממשאבים טבעיים. בפרט, אקטינומיצטים ידועים כשימושיים כאנטיביוטיקה אנטי-טפילית עבור נמטודות בשל יכולתם לייצר מטבוליטים משניים שונים כגון אברמקטין, התרכובת המובילה של איברמקטין ובלאומיצין ונגזרותיו, המשמשים רפואית כגורם אנטי-סרטני21,22. כמו כן, מגוון תרכובות קוטלי עשבים התגלו מאקטינומיצטים, שחלקן כבר נמצאות בשימוש מסחרי1,23. לכן, ניתוח מטבוליטים של אקטינומיצטים לבידוד מוצרים טבעיים בעלי פעילויות ביולוגיות רצויות נחשב לאסטרטגיה יעילה. במחקר זה, גילינו תרכובת חדשה, קומאמונאמיד, מ-S. werraensis וסינתזנו אותה בהצלחה. חומצה אורסונית היא תוצר ביניים סינתטי של אורבנמיד ונגזרותיו. היא יכולה לגרום לעיקול שורשים אופייני, להפגין פעילות קוטלי עשבים בינונית עד חזקה, ולפגוע באופן ישיר או עקיף במיקרוטובולים של צמחים. עם זאת, מנגנון הפעולה של חומצה אורמוטונית עשוי להיות שונה מזה של מעכבי מיקרוטובולים קיימים, מכיוון ש-KAND 11 גם משבש את סיבי האקטין וגורם למוות תאי, דבר המצביע על מנגנון בקרה שבו חומצה אורמוטונית ונגזרותיה משפיעות על מגוון רחב של מבנים ציטוסקלטליים.
אפיון מפורט נוסף של חומצה אורבנונית יסייע להבין טוב יותר את מנגנון הפעולה של חומצה אורבנונית. בפרט, המטרה הבאה היא להעריך את יכולתה של חומצה אורסונית להיקשר למיקרוטובולים מחומרים מופחתים כדי לקבוע האם חומצה אורסונית ונגזרותיה פועלות ישירות על המיקרוטובולים ומפרקות אותן, או שמא פעולתן גורמת לחוסר יציבות של המיקרוטובולים. בנוסף, במקרה בו מיקרוטובולים אינם מטרה ישירה, זיהוי אתר הפעולה והמטרות המולקולריות של חומצה אורסונית על תאי צמחים יסייע להבין טוב יותר את תכונותיהם של תרכובות קשורות ודרכים אפשריות לשיפור הפעילות הקוטלת עשבים. מבחן הפעילות הביולוגית שלנו גילה את היכולת הציטוטוקסית הייחודית של חומצה אורסונית על גדילת צמחים כמו ארבידופסיס ת'ליאנה, טבק ועור הכבד, בעוד שלא תאי E. coli ולא תאי HeLa הושפעו. רעילות מועטה או ללא רעילות לתאי בעלי חיים היא יתרון של נגזרות חומצה אורסונית אם הן מפותחות כקוטלי עשבים לשימוש בשדות חקלאיים פתוחים. ואכן, מכיוון שמיקרוטובולים הם מבנים נפוצים באיקריוטים, עיכובם הסלקטיבי בצמחים הוא דרישה מרכזית לקוטלי עשבים. לדוגמה, פרופיליזמיד, חומר להסרת פולימריזציה של מיקרוטובולים הנקשר ישירות לטובולין ומעכב פולימריזציה, משמש כקוטל עשבים בשל רעילותו הנמוכה לתאי בעלי חיים24. בניגוד לדיסופירמיד, לבנזמידים קשורים יש ספציפיות מטרה שונה. בנוסף למיקרוטובולים צמחיים, RH-4032 או בנזוקסמיד מעכבים גם מיקרוטובולים של תאי בעלי חיים או אומיציטים, בהתאמה, וזלילאמיד משמש כקוטל פטריות בשל הפיטוטוקסיות הנמוכה שלו25,26,27. הדוב שהתגלה לאחרונה ונגזרותיו מפגינים ציטוטוקסיות סלקטיבית כנגד צמחים, אך ראוי לציין כי שינויים נוספים עשויים לשנות את הספציפיות למטרה שלהם, ולספק נגזרות נוספות לשליטה בפטריות פתוגניות או אומיציטים.
התכונות הייחודיות של חומצה אורבנונית ונגזרותיה שימושיות לפיתוחה כקוטלי עשבים ולשימוש ככלי מחקר. חשיבותו של שלד התא בשליטה על צורת תאי הצמח מוכרת באופן נרחב. מחקרים קודמים הראו שצמחים פיתחו מנגנונים מורכבים של ארגון מיקרוטובולים קורטיקליים על ידי שליטה בדינמיקה של מיקרוטובולים כדי לשלוט כראוי במורפוגנזה. מספר רב של מולקולות האחראיות על ויסות פעילות המיקרוטובולים זוהו, ומחקר קשור עדיין נמשך3,4,28. ההבנה הנוכחית שלנו לגבי דינמיקת מיקרוטובולים בתאי צמחים אינה מסבירה במלואה את מנגנוני ארגון המיקרוטובולים הקורטיקליים. לדוגמה, למרות שגם דיסופירמיד וגם אוריזלין יכולים לפרק פולימריזציה של מיקרוטובולים, דיסופירמיד גורם לעיוות שורשים חמור בעוד שלאוריזלין יש השפעה קלה יחסית. יתר על כן, מוטציות בטובולין, המייצב מיקרוטובולים, גורמות גם לדקסטרוטציה בשורשים, בעוד שפקליטקסל, המייצב גם את הדינמיקה של המיקרוטובולים, לא עושה זאת. לכן, לימוד וזיהוי המטרות המולקולריות של חומצה אורסולית אמורים לספק תובנות חדשות לגבי ויסות המיקרוטובולים קורטיקליים בצמחים. באופן דומה, השוואות עתידיות בין כימיקלים יעילים בקידום צמיחה מעוותת, כגון דיסופירמיד, לבין כימיקלים פחות יעילים, כגון אוריזלין או חומצה קומאמוטורית, יספקו רמזים כיצד מתרחשת צמיחה מעוותת.
מצד שני, סידורים מחדש של שלדי התא הקשורים להגנה הם אפשרות נוספת להסביר את הציטוטוקסיות של חומצה אורסונית. זיהום של פתוגן או החדרת חומר גורם לתאי צמחים גורמים לעיתים להרס שלד התא ולמות תאים לאחר מכן29. לדוגמה, דווח כי קריפטוקסנטין שמקורו באומיציט משבש את המיקרוטובולים ואת סיבי האקטין לפני מוות תאי טבק, בדומה למה שקורה בטיפול ב-KAND30,31. הדמיון בין תגובות הגנה לתגובות תאיות הנגרמות על ידי חומצה אורסונית הוביל אותנו להשערה שהן מפעילות תהליכים תאיים נפוצים, אם כי ניכרת השפעה מהירה וחזקה יותר של חומצה אורסונית בהשוואה לקריפטוקסנטין. עם זאת, מחקרים הראו כי שיבוש סיבי האקטין מקדם מוות תאי ספונטני, שלא תמיד מלווה בשיבוש מיקרוטובולים29. בנוסף, נותר לראות האם הפתוגן או הגורם הגורם לצמיחה מעוותת של שורשים, כפי שעושים נגזרות של חומצה אורסונית. לפיכך, ידע מולקולרי המקשר תגובות הגנה ושלד התא הוא בעיה אטרקטיבית שיש לטפל בה. על ידי ניצול נוכחותן של תרכובות בעלות משקל מולקולרי נמוך הקשורות לחומצה אורסונית, כמו גם מגוון נגזרות בעלות עוצמות משתנות, הן עשויות לספק הזדמנויות למקד מנגנונים תאיים לא ידועים.
יחד, גילוי ויישום של תרכובות חדשות המווסתות את הדינמיקה של מיקרוטובולים יספקו שיטות רבות עוצמה לטיפול במנגנונים המולקולריים המורכבים העומדים בבסיס קביעת צורת תאי צמח. בהקשר זה, התרכובת שפותחה לאחרונה, חומצה אורמוטונית, המשפיעה על מיקרוטובולים וסיבעי אקטין ומשרה מוות תאי, עשויה לספק הזדמנות לפענח את הקשר בין בקרת מיקרוטובולים לבין מנגנונים אחרים אלה. לפיכך, ניתוח כימי וביולוגי באמצעות חומצה אורבנונית יעזור לנו להבין את מנגנוני הרגולציה המולקולריים השולטים בשלד התא של הצמח.
יש לחסן את S. werraensis MK493-CF1 לתוך בקבוק ארלנמאייר מבולבל בנפח 500 מ"ל המכיל 110 מ"ל של מצע זרעים המורכב מ-2% (w/v) גלקטוז, 2% (w/v) משחת תמצית, 1% (w/v) Bacto composition. סויטון (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) תמצית תירס (KOGOSTCH Co., Ltd., יפן), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 ו-0.2% CaCO3 במים מזוקקים (pH 7.4 לפני עיקור). תרביות הזרעים הודגרו על מנער סיבובי (180 סל"ד) ב-27 מעלות צלזיוס למשך יומיים. גידול ייצורי בוצע באמצעות תסיסה במצב מוצק. תרבית הזרעים (7 מ"ל) הועברה לבקבוק K-1 בנפח 500 מ"ל המכיל 40 גרם של מצע ייצור המורכב מ-15 גרם שעורה דחוסה (MUSO Co., Ltd., יפן) ו-25 גרם של מים מזוקקים (pH לא הותאם לפני עיקור). התסיסה בוצעה ב-30 מעלות צלזיוס בחושך במשך 14 ימים. חומר התסיסה חולץ עם 40 מ"ל EtOH לבקבוק וצנטריפוגה (1500 גרם, 4 מעלות צלזיוס, 10 דקות). הנוזל העליון של התרבית (60 מ"ל) חולץ עם תערובת של 10% MeOH/EtOAc. השכבה האורגנית התאודה תחת לחץ מופחת לקבלת שארית (59.5 מ"ג), אשר עברה תהליך HPLC עם שחרור גרדיאנט (0-10 דקות: 90%) על עמודת פאזה הפוכה (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 מיקרון, קוטר פנימי 10 מ"מ × אורך 250 מ"מ) H2O/CH3CN, 10-35 דקות: 90% H2O/CH3CN ל-70% H2O/CH3CN (גרדיאנט), 35-45 דקות: 90% H2O/EtOH, 45-155 דקות: 90% H2O/EtOH ל-100% EtOH (גרדיאנט (גרדיאנט), 155-200 דקות: 100% EtOH) בקצב זרימה של 1.5 מ"ל/דקה, קומאמונאמיד (1, 36.0 מ"ג) בודד כאבקה אמורפית לבנה.
קומאמוטומיד(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz, 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ ערך מחושב: 141.0659, ערך נמדד: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
זרעי קולומביה (Col-0) התקבלו ממרכז המשאבים הביולוגיים של ארבידופסיס (ABRC) באישור לשימוש מחקרי. זרעי Col-0 גודלו ותוחזקו בתנאי מעבדה שלנו ושימשו כצמחי ארבידופסיס מסוג בר. זרעי ארבידופסיס עברו עיקור שטחי וגודלו במדיום Murashige ו-Skoog בחצי חוזק המכיל 2% סוכרוז (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-מורפולינו)אתנסולפונית חומצה (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) ו-1.5% אגר (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, בטמפרטורה של 23 מעלות צלזיוס ובאור קבוע. זרעי המוטציה phs1-1 סופקו על ידי T. Hashimoto (מכון נארה למדע וטכנולוגיה).
זרעים מזן SR-1 סופקו על ידי T. Hashimoto (מכון נארה למדע וטכנולוגיה) ושימשו כצמחי טבק מסוג בר. זרעי הטבק עוקרו על פני השטח והושרו במים סטריליים במשך שלושה לילות כדי לקדם נביטה, לאחר מכן הוכנסו לתמיסה חצי-חוזקה המכילה 2% סוכרוז, 0.05% (w/v) MES ו-0.8% גומי גלן (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. ומדיום Skoog) עם pH 5.7 והודגרו ב-23°C תחת אור קבוע.
זן Tak-1 סופק על ידי ט. קוצ'י (אוניברסיטת קיוטו) ושימש כיחידת הניסוי הסטנדרטית למחקר צמחי הכבד. ג'מה התקבלה מצמחים מתורבתים שעברו עיקור ולאחר מכן הועלתה על מצע Gamborg B5 (Fujifilm Wako Pure Chemical) המכיל 1% סוכרוז ו-0.3% גומי גלן והודגרה ב-23 מעלות צלזיוס תחת אור רציף.
תאי טבק BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) סופקו על ידי S. Hasezawa (אוניברסיטת טוקיו). תאי BY-2 דוללו פי 95 במדיום Linsmeier and Skoog שעבר שינוי ותוספו להם מדי שבוע חומצה 2,4-dichlorophenoxyacetic 32. תרחיף התאים עורבב על מנער סיבובי במהירות 130 סל"ד ב-27 מעלות צלזיוס בחושך. שטפו את התאים עם נפח פי 10 של מדיום טרי והשעו אותם מחדש באותו מדיום. נוצרו קווי תאים טרנסגניים BY-2 המבטאים ביציבות את סמן המיקרוטובולים TagRFP-TUA6 או את סמן פילמנט האקטין GFP-ABD2 תחת פרומוטר 35S של נגיף פסיפס הכרובית כמתואר 33,34,35. ניתן לתחזק ולסנכרן קווי תאים אלה באמצעות הליכים דומים לאלה ששימשו עבור קו התאים BY-2 המקורי.
תאי HeLa גודלו במדיום Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) (Life Technologies) בתוספת 10% סרום בקר עוברי, 1.2 יחידות/מ"ל פניצילין ו-1.2 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
כל הניסויים המתוארים בכתב יד זה בוצעו בהתאם לתקנות והנחיות הבטיחות הביולוגית היפניות.
התרכובות הומסו בדימתיל סולפוקסיד (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) כתמיסות מלאי ודוללו במדיום MS עבור ארבידופסיס ובמדיום טבק או מדיום גמבורג B5 עבור צמח הכבד. עבור בדיקת עיכוב צמיחת השורשים, נזרעו יותר מ-10 זרעים לצלחת על מדיום אגר המכיל את התרכובות המצוינות או DMSO. הזרעים הודגרו בתא גידול במשך 7 ימים. השתילים צולמו ונמדד אורך השורשים. עבור בדיקת נביטת ארבידופסיס, נזרעו 48 זרעים לצלחת על מדיום אגר המכיל 200 מיקרומולר תרכובת או DMSO. זרעי ארבידופסיס גודלו בתא גידול ומספר השתילים הנבטים נספר 7 ימים לאחר הנביטה (dag). עבור בדיקת נביטת טבק, נזרעו 24 זרעים לצלחת על מדיום אגר המכיל 200 מיקרומולר KAND או DMSO. זרעי טבק גודלו בתא גידול ומספר השתילים הנבטים נספר לאחר 14 ימים. עבור מבחן עיכוב הגדילה של צמח הכבד, 9 עוברים מכל צלחת הונחו על מצע אגר המכיל את הריכוזים המצוינים של KAND או DMSO והודגרו בתא גידול במשך 14 ימים.
השתמשו בשתילים מוכתמים ב-5 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד (PI) כדי להמחיש את ארגון המריסטם של השורש. אותות PI נצפו על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי TCS SPE (Leica Microsystems).
צביעה היסטוכימית של שורשים עם β-גלוקורונידאז (GUS) בוצעה בהתאם לפרוטוקול שתואר על ידי מלאמי ובנפיי36. שתילים קובעו באצטון 90% למשך הלילה, נצבעו ב-0.5 מ"ג/מ"ל של חומצה 5-ברומו-4-כלורו-3-אינדוליל-β-d-גלוקורונית בבופר GUS למשך שעה אחת והוכנסו לתמיסת כלוראלדהיד מיובשת (8 גרם כלוראל הידראט, 2 מ"ל מים ו-1 מ"ל גליצרול) ונצפו באמצעות מיקרוסקופיית ניגודיות דיפרנציאלית באמצעות מיקרוסקופ Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
זוויות השורש נמדדו על שתילים בני 7 ימים שגודלו על פלטות המונחות אנכית. מדדו את זווית השורש מכיוון וקטור הכבידה כמתואר בשלב 6.
סידור המיקרוטובולים הקורטיקליים נצפה כמתואר, עם שינויים קלים בפרוטוקול 37. נוגדן אנטי-β-טובולין (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) ו-IgG אנטי-עכבר מצומד ל-Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific: A32723) שימשו כנוגדנים ראשוניים ומשניים בדילולים של 1:1000 ו-1:100, בהתאמה. תמונות פלואורסצנציה נרכשו באמצעות מיקרוסקופ סורק לייזר קונפוקלי TCS SPE (Leica Microsystems). רכשו תמונות Z-stack וצרו השלכות בעוצמה מקסימלית בהתאם להוראות היצרן.
בדיקת התפשטות תאי HeLa בוצעה באמצעות ערכת ספירת תאים 8 (Dojindo) בהתאם להוראות היצרן.
גידול E. coli DH5α נותח על ידי מדידת צפיפות התאים בתרבית באמצעות ספקטרופוטומטר ב-600 ננומטר (OD600).
ארגון ציטוסקלטלי בתאי BY-2 טרנסגניים נצפה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במכשיר סריקה קונפוקלית CSU-X1 (Yokogawa) ובמצלמת sCMOS (Zyla, Andor Technology). צפיפות הציטוסקלטלית הוערכה באמצעות ניתוח תמונות, אשר כימת את אחוז הפיקסלים הציטוסקלטליים בקרב הפיקסלים הציטופלזמיים בתמונות קונפוקליות באמצעות תוכנת ImageJ כמתואר38,39.
כדי לזהות מוות תאי בתאי BY-2, מנה של תרחיף התאים הודגרה עם 0.05% כחול אוונס למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. צביעה סלקטיבית של תאים מתים בכחול אוונס תלויה בחילוץ הצבע מתאים חיים על ידי קרום הפלזמה השלם40. תאים צבועים נצפו באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (BX53, Olympus).
תאי HeLa גודלו ב-DMEM בתוספת 10% FBS באינקובטור לח בטמפרטורה של 37°C ו-5% CO2. התאים טופלו ב-100 מיקרומולר KAND 11, חומצה קומאמונאמית 6, קומאמונאמיד 1, 100 ננוגרם/מ"ל קולצמיד (Gibco), או 100 ננוגרם/מ"ל נוקודמייז (Sigma) למשך 6 שעות ב-37°C. התאים קובעו עם MetOH למשך 10 דקות ולאחר מכן עם אצטט למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. תאים קובעו הודגרו עם נוגדן ראשוני β-טובולין (1D4A4, Proteintech: 66240-1) מדולל ב-0.5% BSA/PBS למשך שעתיים, נשטפו 3 פעמים עם TBST, ולאחר מכן הודגרו עם נוגדן עז Alexa Fluor. 488 שעה. – IgG עכברי (Thermo Fisher Scientific: A11001) ו-15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) מדולל ב-0.5% BSA/PBS. לאחר שטיפה עם TBST שלוש פעמים, נצפו תאים צבועים במיקרוסקופ הפוך Nikon Eclipse Ti-E. התמונות צולמו באמצעות מצלמת CCD מקוררת Hamamatsu ORCA-R2 באמצעות תוכנת MetaMorph (Molecular Devices).