תודה שביקרתם באתר Nature.com. גרסת הדפדפן בה אתם משתמשים תמכה ב-CSS באופן מוגבל. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אנו ממליצים להשתמש בגרסה חדשה יותר של הדפדפן שלכם (או להשבית את מצב התאימות ב-Internet Explorer). בינתיים, כדי להבטיח תמיכה מתמשכת, אנו מציגים את האתר ללא עיצוב או JavaScript.
שילובים של תרכובות קוטלי חרקים שמקורן בצמחים עשויים להפגין אינטראקציות סינרגטיות או אנטגוניסטיות כנגד מזיקים. בהתחשב בהתפשטות המהירה של מחלות הנישאות על ידי יתושי Aedes והעמידות הגוברת של אוכלוסיות יתושי Aedes לקוטלי חרקים מסורתיים, נוסחו עשרים ושמונה שילובים של תרכובות טרפן המבוססות על שמנים אתריים צמחיים ונבדקו כנגד שלבי הזחל והבוגרים של Aedes aegypti. בתחילה הוערכו חמישה שמנים אתריים צמחיים (EOs) ליעילותם קוטלת הזחלים ולשימוש במבוגרים, ושתי תרכובות עיקריות זוהו בכל EO על סמך תוצאות GC-MS. התרכובות העיקריות שזוהו נרכשו, כלומר דיאליל דיסולפיד, דיאליל טריסולפיד, קרבון, לימונן, אאוגנול, מתיל אאוגנול, אקליפטול, אאודסמול ואלפא-פינן של יתושים. לאחר מכן הוכנו שילובים בינאריים של תרכובות אלו באמצעות מינונים תת-קטלניים והשפעותיהם הסינרגטיות והאנטגוניסטיות נבדקו ונקבעו. תרכובות קוטלי הזחלים הטובות ביותר מתקבלות על ידי ערבוב לימונן עם דיאליל דיסולפיד, ותרכובות קוטלי הזחלים הטובות ביותר מתקבלות על ידי ערבוב קרבון עם לימונן. קוטל הזחלים הסינתטי Temphos, המשמש מסחרית, ותרופה למבוגרים Malathion נבדקו בנפרד ובשילובים בינאריים עם טרפנואידים. התוצאות הראו כי השילוב של טמפוס ודיאליל דיסולפיד ומלאתיון ואאודסמול היה השילוב היעיל ביותר. שילובים רבי עוצמה אלה טומנים בחובם פוטנציאל לשימוש נגד Aedes aegypti.
שמנים אתריים צמחיים (EOs) הם מטבוליטים משניים המכילים תרכובות ביו-אקטיביות שונות והופכים לחשובים יותר ויותר כחלופה לחומרי הדברה סינתטיים. הם לא רק ידידותיים לסביבה וידידותיים למשתמש, אלא שהם גם תערובת של תרכובות ביו-אקטיביות שונות, מה שמפחית גם את הסבירות לפתח עמידות לתרופות1. באמצעות טכנולוגיית GC-MS, חוקרים בחנו את מרכיבי שמנים אתריים צמחיים שונים וזיהו יותר מ-3,000 תרכובות מ-17,500 צמחים ארומטיים2, שרובם נבדקו לתכונות קוטלי חרקים ודווחו כבעלי השפעות קוטלי חרקים3,4. כמה מחקרים מדגישים כי הרעילות של המרכיב העיקרי של התרכובת זהה או גדולה מזו של תחמוצת האתילן הגולמית שלה. אך השימוש בתרכובות בודדות עשוי שוב להשאיר מקום להתפתחות עמידות, כפי שקורה בקוטלי חרקים כימיים5,6. לכן, המוקד הנוכחי הוא על הכנת תערובות של תרכובות מבוססות תחמוצת אתילן כדי לשפר את יעילות קוטלי החרקים ולהפחית את הסבירות לעמידות באוכלוסיות מזיקים יעד. תרכובות פעילות בודדות הקיימות באורזים אתריים עשויות להפגין השפעות סינרגטיות או אנטגוניסטיות בשילובים המשקפים את הפעילות הכוללת של האורזים האתריים, עובדה שהודגשה היטב במחקרים שביצעו חוקרים קודמים7,8. תוכנית הדברת הווקטורים כוללת גם אורזים אתריים ומרכיביו. הפעילות הקוטלת יתושים של שמנים אתריים נחקרה בהרחבה על יתושי Culex ואנופלס. מספר מחקרים ניסו לפתח חומרי הדברה יעילים על ידי שילוב צמחים שונים עם חומרי הדברה סינתטיים המשמשים מסחרית כדי להגביר את הרעילות הכוללת ולמזער תופעות לוואי9. אך מחקרים של תרכובות כאלה נגד יתוש Aedes aegypti נותרו נדירים. התקדמות במדעי הרפואה ופיתוח תרופות וחיסונים סייעו במאבק בכמה מחלות הנישאות על ידי וקטורים. אך נוכחותם של זנים שונים של הנגיף, המועבר על ידי יתוש Aedes aegypti, הובילה לכישלון תוכניות חיסון. לכן, כאשר מחלות כאלה מתרחשות, תוכניות הדברת וקטורים הן האפשרות היחידה למנוע את התפשטות המחלה. בתרחיש הנוכחי, הדברה ב-Aedes aegypti חשובה מאוד מכיוון שהיא וקטור מפתח של מגוון נגיפים והסרוטיפים שלהם הגורמים לקדחת דנגי, זיקה, קדחת דנגי דימומית, קדחת צהובה ועוד. הדבר הבולט ביותר הוא העובדה שמספר המקרים של כמעט כל המחלות הנישאות על ידי Aedes aegypti עולה מדי שנה במצרים ועולה ברחבי העולם. לכן, בהקשר זה, קיים צורך דחוף לפתח אמצעי בקרה ידידותיים לסביבה ויעילים עבור אוכלוסיות Aedes aegypti. מועמדים פוטנציאליים בהקשר זה הם אורגניים אורגניים (EOs), התרכובות המרכיבות אותם והשילובים שלהם. לכן, מחקר זה ניסה לזהות שילובים סינרגטיים יעילים של תרכובות EO צמחיות מרכזיות מחמישה צמחים בעלי תכונות קוטלי חרקים (למשל, נענע, בזיליקום קדוש, אקליפטוס מנומר, אליום גופרית ומללוקה) נגד Aedes aegypti.
כל ה-EO שנבחרו הדגימו פעילות קוטלת זחלים פוטנציאלית כנגד Aedes aegypti עם LC50 למשך 24 שעות שנע בין 0.42 ל-163.65 ppm. הפעילות הקוטלת זחלים הגבוהה ביותר נרשמה עבור EO מנטה (Mp) עם ערך LC50 של 0.42 ppm לאחר 24 שעות, ואחריו שום (As) עם ערך LC50 של 16.19 ppm לאחר 24 שעות (טבלה 1).
למעט Ocimum Sainttum, חומר EO מסוג Os, כל ארבעת חומרי ה-EO האחרים שנבדקו הראו השפעות אלרקטידיות ברורות, עם ערכי LC50 שנעו בין 23.37 ל-120.16 ppm במהלך תקופת החשיפה של 24 שעות. חומר EO מסוג Thymophilus striata (Cl) היה היעיל ביותר בהריגת מבוגרים עם ערך LC50 של 23.37 ppm תוך 24 שעות מחשיפה, ואחריו Eucalyptus maculata (Em) עם ערך LC50 של 101.91 ppm (טבלה 1). מצד שני, ערך LC50 עבור חומר EO טרם נקבע מכיוון ששיעור התמותה הגבוה ביותר של 53% נרשם במינון הגבוה ביותר (איור משלים 3).
שתי התרכובות המרכיבות העיקריות בכל EO זוהו ונבחרו על סמך תוצאות מסד הנתונים של ספריית NIST, אחוז שטח כרומטוגרמת GC ותוצאות ספקטרום MS (טבלה 2). עבור EO As, התרכובות העיקריות שזוהו היו דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד; עבור EO Mp התרכובות העיקריות שזוהו היו קרבון ולימונן, עבור EO Em התרכובות העיקריות שזוהו היו אאודסמול ואקליפטול; עבור EO Os, התרכובות העיקריות שזוהו היו אאוגנול ומתיל אאוגנול, ועבור EO Cl, התרכובות העיקריות שזוהו היו אאוגנול ו-α-פינן (איור 1, איורים משלימים 5-8, טבלה משלימה 1-5).
תוצאות ספקטרומטריית מסות של הטרפנואידים העיקריים של שמנים אתריים נבחרים (A-דיאליל דיסולפיד; B-דיאליל טריסולפיד; C-אאוגנול; D-מתיל אאוגנול; E-לימונן; F-צפרון ארומטי; G-α-פינן; H-צינול; R-אאודמול).
סך של תשעה תרכובות (דיאליל דיסולפיד, דיאליל טריסולפיד, אאוגנול, מתיל אאוגנול, קרבון, לימונן, אקליפטול, אאודסמול, α-פינן) זוהו כתרכובות יעילות שהן המרכיבים העיקריים של EO ונבדקו ביולוגית בנפרד כנגד Aedes aegypti בשלבי הזחל. לתרכובת אאודסמול הייתה הפעילות הקוטלת זחלים הגבוהה ביותר עם ערך LC50 של 2.25 ppm לאחר 24 שעות של חשיפה. נמצא כי לתרכובות דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד גם השפעות קוטלות זחלים פוטנציאליות, עם מינונים תת-קטלניים ממוצעים בטווח של 10-20 ppm. פעילות קוטלת זחלים מתונה נצפתה שוב עבור התרכובות אאוגנול, לימונן ואקליפטול עם ערכי LC50 של 63.35 ppm, 139.29 ppm ו-181.33 ppm לאחר 24 שעות, בהתאמה (טבלה 3). עם זאת, לא נמצא פוטנציאל משמעותי לקוטלי זחלים של מתיל אאוגנול וקרבון, אפילו במינונים הגבוהים ביותר, ולכן ערכי LC50 לא חושבו (טבלה 3). לקוטלי הזחלים הסינתטי Temephos היה ריכוז קטלני ממוצע של 0.43 ppm כנגד Aedes aegypti במשך 24 שעות חשיפה (טבלה 3, טבלה משלימה 6).
שבע תרכובות (דיאליל דיסולפיד, דיאליל טריסולפיד, אקליפטול, α-פינן, אאודסמול, לימונן וקרבון) זוהו כתרכובות העיקריות של EO יעיל ונבדקו בנפרד כנגד יתושי Aedes מצריים בוגרים. על פי ניתוח רגרסיה של Probit, נמצא כי לאאודסמול הפוטנציאל הגבוה ביותר עם ערך LC50 של 1.82 ppm, ואחריו אקליפטול עם ערך LC50 של 17.60 ppm לאחר חשיפה של 24 שעות. חמש התרכובות הנותרות שנבדקו היו מזיקות במידה בינונית למבוגרים עם LC50 שנעו בין 140.79 ל-737.01 ppm (טבלה 3). המלטיון האורגנו-זרחן הסינתטי היה פחות חזק מאשר אאודסמול וגבוה משש התרכובות האחרות, עם ערך LC50 של 5.44 ppm במהלך תקופת החשיפה של 24 שעות (טבלה 3, טבלה משלימה 6).
שבע תרכובות עופרת חזקות וטמפוסאט אורגנו-זרחן נבחרו כדי לגבש שילובים בינאריים של מינוני LC50 שלהם ביחס של 1:1. סך של 28 שילובים בינאריים הוכנו ונבדקו ליעילותם קוטלת הזחלים כנגד Aedes aegypti. תשעה שילובים נמצאו סינרגטיים, 14 שילובים היו אנטגוניסטיים, וחמישה שילובים לא היו קוטלי זחלים. מבין השילובים הסינרגטיים, השילוב של דיאליל דיסולפיד וטמופול היה היעיל ביותר, עם תמותה של 100% שנצפתה לאחר 24 שעות (טבלה 4). באופן דומה, תערובות של לימונן עם דיאליל דיסולפיד ואאוגנול עם טימטפוס הראו פוטנציאל טוב עם תמותת זחלים נצפית של 98.3% (טבלה 5). 4 השילובים הנותרים, כלומר אאודסמול בתוספת אקליפטול, אאודסמול בתוספת לימונן, אקליפטול בתוספת אלפא-פינן, אלפא-פינן בתוספת טמפוס, הראו גם יעילות קוטלת זחלים משמעותית, עם שיעורי תמותה שנצפו מעל 90%. שיעור התמותה הצפוי קרוב ל-60-75%. (טבלה 4). עם זאת, השילוב של לימונן עם α-פינן או אקליפטוס הראה תגובות אנטגוניסטיות. באופן דומה, נמצא כי תערובות של טמפוס עם אאוגנול או אקליפטוס או אאודסמול או דיאליל טריסולפיד הן בעלות השפעות אנטגוניסטיות. באופן דומה, השילוב של דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד והשילוב של כל אחת מהתרכובות הללו עם אאודסמול או אאוגנול הם אנטגוניסטיים בפעולתם קוטלת הזחלים. דווח גם על אנטגוניזם בשילוב של אאודסמול עם אאוגנול או α-פינן.
מתוך כל 28 התערובות הבינאריות שנבדקו לפעילות חומצית במבוגרים, 7 שילובים היו סינרגטיים, 6 לא השפיעו, ו-15 היו אנטגוניסטיות. תערובות של אאודסמול עם אקליפטוס ולימונן עם קרבון נמצאו יעילות יותר משילובים סינרגטיים אחרים, עם שיעורי תמותה ב-24 שעות של 76% ו-100%, בהתאמה (טבלה 5). נצפה כי מלתיון מציג אפקט סינרגטי עם כל שילובי התרכובות למעט לימונן ודיאליל טריסולפיד. מצד שני, נמצא אנטגוניזם בין דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד לבין השילוב של כל אחד מהם עם אקליפטוס, או אקליפטול, או קרבון, או לימונן. באופן דומה, שילובים של α-פינן עם אאודסמול או לימונן, אקליפטול עם קרבון או לימונן, ולימונן עם אאודסמול או מלתיון הראו השפעות אנטגוניסטיות קוטלי זחלים. עבור ששת השילובים הנותרים, לא היה הבדל משמעותי בין התמותה הצפויה לתמותה הנצפית (טבלה 5).
בהתבסס על השפעות סינרגטיות ומינונים תת-קטלניים, נבחרה בסופו של דבר הרעילות הקוטלת זחלים שלהם כנגד מספר רב של יתושי Aedes aegypti ונבדקה עוד יותר. התוצאות הראו שתמותת הזחלים שנצפתה באמצעות השילובים הבינאריים אאוגנול-לימונן, דיאליל דיסולפיד-לימונן ודיאליל דיסולפיד-טייםפוס הייתה 100%, בעוד שתמותת הזחלים הצפויה הייתה 76.48%, 72.16% ו-63.4%, בהתאמה (טבלה 6). השילוב של לימונן ואאודסמול היה פחות יעיל יחסית, עם תמותת זחלים של 88% שנצפתה במהלך תקופת החשיפה של 24 שעות (טבלה 6). לסיכום, ארבעת השילובים הבינאריים שנבחרו הדגימו גם השפעות קוטלות זחלים סינרגטיות כנגד Aedes aegypti כאשר יושמו בקנה מידה גדול (טבלה 6).
שלושה שילובים סינרגטיים נבחרו עבור הביו-אסאי של מבוגרים (adultocidal assay) לשליטה באוכלוסיות גדולות של Aedes aegypti בוגרים. כדי לבחור שילובים לבדיקה על מושבות חרקים גדולות, התמקדנו תחילה בשני שילובי הטרפנים הסינרגטיים הטובים ביותר, כלומר קרבון פלוס לימונן ואקליפטול פלוס אאודסמול. שנית, השילוב הסינרגטי הטוב ביותר נבחר משילוב של מלתיון אורגנופוספט סינתטי וטרפנואידים. אנו מאמינים שהשילוב של מלתיון ואאודסמול הוא השילוב הטוב ביותר לבדיקה על מושבות חרקים גדולות בשל התמותה הגבוהה ביותר שנצפתה וערכי LC50 נמוכים מאוד של המרכיבים המועמדים. מלתיון מציג סינרגיזם בשילוב עם α-פינן, דיאליל דיסולפיד, אקליפטוס, קרבון ואאודסמול. אבל אם נבחן את ערכי LC50, לאאודסמול יש את הערך הנמוך ביותר (2.25 ppm). ערכי ה-LC50 המחושבים של מלאתיון, α-פינן, דיאליל דיסולפיד, אקליפטול וקרבון היו 5.4, 716.55, 166.02, 17.6 ו-140.79 ppm בהתאמה. ערכים אלה מצביעים על כך שהשילוב של מלאתיון ואאודסמול הוא השילוב האופטימלי מבחינת מינון. התוצאות הראו כי לשילובים של קארבון פלוס לימונן ואאודסמול פלוס מלאתיון הייתה תמותה נצפית של 100% בהשוואה לתמותה צפויה של 61% עד 65%. שילוב נוסף, אאודסמול פלוס אקליפטול, הראה שיעור תמותה של 78.66% לאחר 24 שעות של חשיפה, בהשוואה לשיעור תמותה צפוי של 60%. שלושת השילובים שנבחרו הפגינו השפעות סינרגטיות גם כאשר יושמו בקנה מידה גדול כנגד Aedes aegypti בוגרים (טבלה 6).
במחקר זה, צמחים נבחרים כמו Mp, As, Os, Em ו-Cl הראו השפעות קטלניות מבטיחות על שלבי הזחל והבוגרים של Aedes aegypti. ל-Mp EO הייתה הפעילות הקוטלת הזחלים הגבוהה ביותר עם ערך LC50 של 0.42 ppm, ואחריה As, Os ו-Em EO עם ערך LC50 של פחות מ-50 ppm לאחר 24 שעות. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם מחקרים קודמים של יתושים וזבובים אחרים מסוג דיפטרוס 10,11,12,13,14. למרות שעוצמת הקוטלת הזחלים של Cl נמוכה יותר מזו של שמנים אתריים אחרים, עם ערך LC50 של 163.65 ppm לאחר 24 שעות, הפוטנציאל שלו כבוגר הוא הגבוה ביותר עם ערך LC50 של 23.37 ppm לאחר 24 שעות. Mp, As ו-Em EO הראו גם פוטנציאל קוטל הזחלים טוב עם ערכי LC50 בטווח של 100-120 ppm בחשיפה של 24 שעות, אך היו נמוכים יחסית מיעילותם הקוטלת הזחלים. מצד שני, אתילן אוקסיד (EO Os) הפגין השפעה אלרקטידית זניחה אפילו במינון הטיפולי הגבוה ביותר. לפיכך, התוצאות מצביעות על כך שהרעילות של אתילן אוקסיד לצמחים עשויה להשתנות בהתאם לשלב ההתפתחותי של היתושים15. זה תלוי גם בקצב חדירתם של אתילן אוקסיד לגוף החרק, באינטראקציה שלהם עם אנזימי מטרה ספציפיים, וביכולת ניקוי הרעלים של היתוש בכל שלב התפתחותי16. מספר רב של מחקרים הראו כי התרכובת המרכיבה העיקרית היא גורם חשוב בפעילות הביולוגית של אתילן אוקסיד, מכיוון שהיא מהווה את רוב התרכובות הכוללות3,12,17,18. לכן, שקלנו שתי תרכובות עיקריות בכל אתילן אוקסיד. בהתבסס על תוצאות GC-MS, זוהו דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד כתרכובות העיקריות של אתילן אוקסיד, דבר התואם דיווחים קודמים19,20,21. למרות שדיווחים קודמים הצביעו על כך שמנטול היה אחד התרכובות העיקריות שלו, קרבון ולימונן זוהו שוב כתרכובות העיקריות של Mp EO22,23. פרופיל ההרכב של Os EO הראה כי אאוגנול ומתיל אאוגנול הן התרכובות העיקריות, בדומה לממצאים של חוקרים קודמים16,24. אקליפטול ואקליפטול דווחו כתרכובות העיקריות הקיימות בשמן עלי Em, דבר התואם את ממצאיהם של חלק מהחוקרים25,26 אך בניגוד לממצאיהם של Olalade ואחרים27. הדומיננטיות של צינאול ו-α-פינן נצפתה בשמן אתרי מללוקה, בדומה למחקרים קודמים28,29. דווחו, ונצפו גם במחקר זה, הבדלים תוך-ספציפיים בהרכב ובריכוז של שמנים אתריים המופקים מאותו מין צמחים במקומות שונים, והם מושפעים מתנאי גידול גיאוגרפיים של צמחים, זמן קציר, שלב התפתחותי או גיל הצמח, הופעת כימותיפים וכו'22,30,31,32. לאחר מכן נרכשו התרכובות המרכזיות שזוהו ונבדקו עבור השפעותיהן קוטלי הזחלים והשפעותיהן על יתושי Aedes aegypti בוגרים. התוצאות הראו כי הפעילות הקוטלת הזחלים של דיאליל דיסולפיד הייתה דומה לזו של EO As גולמי. אך פעילותו של דיאליל טריסולפיד גבוהה יותר מזו של EO As. תוצאות אלו דומות לאלו שהתקבלו על ידי Kimbaris et al. 33 על Culex philippines. עם זאת, שני תרכובות אלו לא הראו פעילות אוטוצידלית טובה כנגד יתושי המטרה, דבר התואם את תוצאותיהם של Plata-Rueda et al 34 על Tenebrio molitor. EO יעיל כנגד שלב הזחל של Aedes aegypti, אך לא כנגד שלב הבוגר. נקבע כי הפעילות הקוטלת הזחלים של התרכובות הבודדות העיקריות נמוכה מזו של EO גולמי. משמעות הדבר היא שיש תפקיד לתרכובות אחרות ולאינטראקציות שלהן באתילן אוקסיד גולמי. למתיל אאוגנול לבדו יש פעילות זניחה, בעוד שאאוגנול לבדו יש פעילות קוטלת זחלים בינונית. מסקנה זו מאשרת, מצד אחד, 35,36, ומצד שני, סותרת את מסקנותיהם של חוקרים קודמים 37,38. הבדלים בקבוצות הפונקציונליות של אאוגנול ומתיל אאוגנול עשויים לגרום לרעילות שונה לאותו חרק מטרה39. נמצא כי לימונן בעל פעילות קוטלת זחלים בינונית, בעוד שההשפעה של קרבון הייתה חסרת משמעות. באופן דומה, הרעילות הנמוכה יחסית של לימונן לחרקים בוגרים והרעילות הגבוהה של קרבון תומכות בתוצאות של כמה מחקרים קודמים40 אך סותרות אחרים41. נוכחות קשרים כפולים הן במיקומים התוך-ציקליים והן במיקומים אקסוציקליים עשויה להגביר את היתרונות של תרכובות אלו כקוטלי זחלים3,41, בעוד שקרבון, שהוא קטון עם פחמני אלפא ובטא בלתי רוויים, עשוי להפגין פוטנציאל גבוה יותר לרעילות במבוגרים42. עם זאת, המאפיינים האינדיבידואליים של לימונן וקרבון נמוכים בהרבה מה-EO M הכולל (טבלה 1, טבלה 3). מבין הטרפנואידים שנבדקו, נמצא כי לאאודסמול יש את הפעילות הקוטלת זחלים ובמבוגרים הגדולה ביותר עם ערך LC50 מתחת ל-2.5 ppm, מה שהופך אותו לתרכובת מבטיחה להדברת יתושי Aedes. ביצועיו טובים יותר מאלה של כל ה-EO Em, אם כי זה לא עולה בקנה אחד עם הממצאים של Cheng ואחרים.40. Eudesmol הוא ססקיטרפן עם שתי יחידות איזופרן שהוא פחות נדיף ממונוטרפנים מחומצנים כמו אקליפטוס ולכן יש לו פוטנציאל גדול יותר כחומר הדברה. לאקליפטול עצמו יש פעילות גדולה יותר במבוגרים מאשר פעילות קוטלת זחלים, ותוצאות ממחקרים קודמים תומכות ומפריכות זאת37,43,44. הפעילות לבדה כמעט דומה לזו של כלוריד EO במבוגרים. למונוטרפן דו-ציקלי נוסף, α-פינן, יש השפעה פחותה במבוגרים על Aedes aegypti מאשר השפעה קוטלת זחלים, שהיא ההפך מההשפעה של כלוריד EO מלא. הפעילות הקוטלת חרקים הכוללת של טרפנואידים מושפעת מהליפופיליות שלהם, נדיפותם, הסתעפות הפחמן, שטח ההיטל, שטח הפנים, הקבוצות הפונקציונליות ומיקומן45,46. תרכובות אלו עשויות לפעול על ידי השמדת הצטברויות תאים, חסימת פעילות נשימתית, הפרעה להעברת דחפים עצביים וכו'. 47 נמצא כי לזרחן האורגני הסינתטי טמפוס יש את הפעילות הגבוהה ביותר נגד זחלים עם ערך LC50 של 0.43 ppm, התואם את נתוני לק - אוטלה 48. פעילות בוגרת של פוספט האורגני הסינתטי מלאתיון דווחה ב-5.44 ppm. למרות ששני פוספטים אורגניים אלו הראו תגובות חיוביות כנגד זני מעבדה של Aedes aegypti, דווח על עמידות יתושים לתרכובות אלו בחלקים שונים של העולם 49. עם זאת, לא נמצאו דיווחים דומים על התפתחות עמידות לתרופות צמחיות 50. לכן, תמציות צמחים נחשבות כחלופות פוטנציאליות לחומרי הדברה כימיים בתוכניות הדברה וקטורית.
ההשפעה הקוטלת זחלים נבדקה על 28 שילובים בינאריים (1:1) שהוכנו מטרפנואידים וטרפנואידים חזקים עם טימטפוס, ו-9 שילובים נמצאו סינרגטיים, 14 אנטגוניסטיים ו-5 אנטגוניסטיים. ללא השפעה. מצד שני, בבדיקת עוצמת הזחלים של מבוגרים, 7 שילובים נמצאו סינרגטיים, 15 שילובים היו אנטגוניסטיים, ו-6 שילובים דווחו כלא בעלי השפעה. הסיבה לכך ששילובים מסוימים מייצרים השפעה סינרגטית עשויה להיות תוצאה של אינטראקציה בו זמנית בין התרכובות המועמדות במסלולים חשובים שונים, או עיכוב רציף של אנזימים מרכזיים שונים של מסלול ביולוגי מסוים51. שילוב של לימונן עם דיאליל דיסולפיד, אקליפטוס או אאוגנול נמצא סינרגטי הן ביישומים בקנה מידה קטן והן ביישומים בקנה מידה גדול (טבלה 6), בעוד שנמצא כי לשילובו עם אקליפטוס או α-פינן יש השפעות אנטגוניסטיות על הזחלים. בממוצע, לימונן נראה כסינרגיסט טוב, כנראה בשל נוכחותן של קבוצות מתיל, חדירה טובה לשכבת הקרנית ומנגנון פעולה שונה52,53. בעבר דווח כי לימונן עלול לגרום להשפעות רעילות על ידי חדירת קוטיקולות חרקים (רעילות מגע), השפעה על מערכת העיכול (נוגד הזנה) או השפעה על מערכת הנשימה (פעילות חיטוי),54 בעוד שפנילפרופנואידים כמו אאוגנול עשויים להשפיע על אנזימים מטבוליים55. לכן, שילובים של תרכובות עם מנגנוני פעולה שונים עשויים להגביר את ההשפעה הקטלנית הכוללת של התערובת. אקליפטול נמצא כסינרגטי עם דיאליל דיסולפיד, אקליפטוס או α-פינן, אך שילובים אחרים עם תרכובות אחרות לא היו קוטלי זחלים או אנטגוניסטיים. מחקרים מוקדמים הראו כי לאקליפטול יש פעילות מעכבת על אצטילכולין אסטראז (AChE), כמו גם על קולטני אוקטאמין ו-GABA56. מאחר שלמונוטרפנים ציקליים, אקליפטול, אאוגנול וכו' עשוי להיות מנגנון פעולה זהה לפעילות הנוירוטוקסית שלהם, 57 ובכך למזער את ההשפעות המשולבות שלהם באמצעות עיכוב הדדי. באופן דומה, נמצא כי השילוב של טמפוס עם דיאליל דיסולפיד, α-פינן ולימונן סינרגטי, דבר התומך בדיווחים קודמים על השפעה סינרגיסטית בין מוצרים צמחיים לאורגנופוספטים סינתטיים 58.
נמצא כי לשילוב של אאודסמול ואקליפטול יש השפעה סינרגיסטית על שלבי הזחל והבוגר של Aedes aegypti, ככל הנראה בשל אופני הפעולה השונים שלהם עקב המבנים הכימיים השונים שלהם. אאודסמול (ססקיטרפן) עשוי להשפיע על מערכת הנשימה 59 ואקליפטול (מונוטרפן) עשוי להשפיע על אצטילכולין אסטראז 60. חשיפה משותפת של המרכיבים לשני אתרי מטרה או יותר עשויה להגביר את ההשפעה הקטלנית הכוללת של השילוב. בבדיקות ביולוגיות של חומרים במבוגרים, נמצא כי מלתיון סינרגטי עם קרבון או אקליפטול או אקליפטול או דיאליל דיסולפיד או α-פינן, דבר המצביע על כך שהוא סינרגטי עם תוספת של לימונן ודי. מועמדים טובים לאלרציקליים סינרגטיים עבור כל תיק תרכובות הטרפן, למעט אליל טריסולפיד. ת'אנגאם וקאת'ירסן 61 דיווחו גם על תוצאות דומות של ההשפעה הסינרגטית של מלתיון עם תמציות צמחים. תגובה סינרגיסטית זו עשויה לנבוע מההשפעות הרעילות המשולבות של מלתיון ופיטוכימיקלים על אנזימים לניקוי רעלים של חרקים. פוספטים אורגניים כמו מלתיון פועלים בדרך כלל על ידי עיכוב אסטראזות ומונואוקסיגנאזות של ציטוכרום P45062,63,64. לכן, שילוב של מלתיון עם מנגנוני פעולה אלה וטרפנים עם מנגנוני פעולה שונים עשוי להגביר את ההשפעה הקטלנית הכוללת על יתושים.
מצד שני, אנטגוניזם מצביע על כך שהתרכובות שנבחרו פחות פעילות בשילוב בהשוואה לכל תרכובת בנפרד. הסיבה לאנטגוניזם בשילובים מסוימים עשויה להיות שתרכובת אחת משנה את התנהגות התרכובת השנייה על ידי שינוי קצב הספיגה, ההפצה, חילוף החומרים או ההפרשה. חוקרים מוקדמים ראו בכך את הגורם לאנטגוניזם בשילובי תרופות. מולקולות מנגנון אפשרי 65. באופן דומה, סיבות אפשריות לאנטגוניזם עשויות להיות קשורות למנגנוני פעולה דומים, תחרות של תרכובות מרכיבות על אותו קולטן או אתר מטרה. במקרים מסוימים, עשוי להתרחש גם עיכוב לא תחרותי של חלבון המטרה. במחקר זה, שתי תרכובות גופרית אורגניות, דיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד, הראו השפעות אנטגוניסטיות, אולי עקב תחרות על אותו אתר מטרה. באופן דומה, שתי תרכובות גופרית אלו הראו השפעות אנטגוניסטיות ולא הייתה להן השפעה בשילוב עם אאודסמול ו-α-פינן. אאודסמול ואלפא-פינן הם מחזוריים באופיים, בעוד שדיאליל דיסולפיד ודיאליל טריסולפיד הם אליפטיים באופיים. בהתבסס על המבנה הכימי, השילוב של תרכובות אלו אמור להגביר את הפעילות הקטלנית הכוללת מכיוון שאתרי המטרה שלהן בדרך כלל שונים34,47, אך בניסוי מצאנו אנטגוניזם, שעשוי להיות נובע מתפקידן של תרכובות אלו במערכות in vivo לא ידועות כתוצאה מאינטראקציה. באופן דומה, השילוב של צינאול ו-α-פינן יצר תגובות אנטגוניסטיות, למרות שחוקרים דיווחו בעבר כי לשני התרכובות יש מטרות פעולה שונות47,60. מכיוון ששתי התרכובות הן מונוטרפנים מחזוריות, ייתכנו כמה אתרי מטרה משותפים שעשויים להתחרות על קישור ולהשפיע על הרעילות הכוללת של הזוגות הקומבינטוריים שנחקרו.
בהתבסס על ערכי LC50 ותמותה שנצפתה, נבחרו שני שילובי הטרפנים הסינרגטיים הטובים ביותר, כלומר זוגות של קרבון + לימונן ואקליפטול + אאודסמול, כמו גם מלאתיון אורגנו-זרחן סינתטי עם טרפנים. השילוב הסינרגטי האופטימלי של תרכובות מלאתיון + אאודסמול נבדק בביולוגיית קוטל חרקים למבוגרים. התמקדו במושבות חרקים גדולות כדי לאשר האם שילובים יעילים אלה יכולים לפעול נגד מספר רב של פרטים במרחבי חשיפה גדולים יחסית. כל השילובים הללו מדגימים אפקט סינרגטי נגד נחילים גדולים של חרקים. תוצאות דומות התקבלו עבור שילוב סינרגטי אופטימלי קוטל זחלים שנבדק נגד אוכלוסיות גדולות של זחלי Aedes aegypti. לפיכך, ניתן לומר כי השילוב הסינרגטי היעיל קוטל זחלים וקוטלי מבוגרים של תרכובות EO צמחיות הוא מועמד חזק נגד כימיקלים סינתטיים קיימים וניתן להשתמש בו גם לשליטה באוכלוסיות Aedes aegypti. באופן דומה, שילובים יעילים של קוטלי זחלים סינתטיים או קוטלי מבוגרים עם טרפנים יכולים לשמש גם כדי להפחית את המינונים של תימטפוס או מלאתיון הניתנים ליתושים. שילובים סינרגטיים רבי עוצמה אלה עשויים לספק פתרונות למחקרים עתידיים על התפתחות עמידות לתרופות ביתושי Aedes.
ביצי Aedes aegypti נאספו במרכז המחקר הרפואי האזורי, דיברוגאר, המועצה ההודית למחקר רפואי, ונשמרו תחת טמפרטורה מבוקרת (28 ± 1 מעלות צלזיוס) ולחות (85 ± 5%) במחלקה לזואולוגיה, אוניברסיטת גאואהטי, בתנאים הבאים: אריבולי תוארו ואחרים. לאחר הבקיעה, הזחלים ניזונו ממזון זחלים (אבקת ביסקוויטים לכלבים ושמרים ביחס של 3:1) והבוגרים ניזונו בתמיסת גלוקוז 10%. החל מהיום השלישי לאחר ההופעה, יתושים בוגרים הורשו למצוץ את דם החולדות הלבקנות. יש להשרות את נייר הסינון במים בכוס ולהניח אותו בכלוב מטילות הביצים.
דגימות צמחים נבחרות, דהיינו עלי אקליפטוס (Myrtaceae), בזיליקום קדוש (Lamiaceae), נענע (Lamiaceae), מללוקה (Myrtaceae) ובצלי אליום (Amaryllidaceae). נאספו מגווהאטי וזוהו על ידי המחלקה לבוטניקה, אוניברסיטת גאואהטי. דגימות הצמחים שנאספו (500 גרם) עברו זיקוק הידרואלקטרי באמצעות מכשיר Clevenger למשך 6 שעות. ה-EO שחולץ נאסף בבקבוקוני זכוכית נקיים ואוחסן ב-4 מעלות צלזיוס למחקר נוסף.
רעילות קוטלת זחלים נחקרה באמצעות נהלים סטנדרטיים שעברו שינוי קל של ארגון הבריאות העולמי 67. השתמשו ב-DMSO כחומר מתחלב. כל ריכוז EO נבדק בתחילה ב-100 ו-1000 ppm, תוך חשיפה של 20 זחלים בכל חוזר. בהתבסס על התוצאות, יושם טווח ריכוזים ותמותה נרשמה בין שעה ל-6 שעות (במרווחים של שעה), וב-24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר הטיפול. ריכוזים תת-קטלניים (LC50) נקבעו לאחר 24, 48 ו-72 שעות של חשיפה. כל ריכוז נבדק בשלושה עותקים יחד עם בקרה שלילית אחת (מים בלבד) ובקרה חיובית אחת (מים שטופלו ב-DMSO). אם מתרחשת התגלמות ויותר מ-10% מהזחלים בקבוצת הביקורת מתים, הניסוי חוזר על עצמו. אם שיעור התמותה בקבוצת הביקורת הוא בין 5-10%, השתמשו בנוסחת תיקון אבוט 68.
השיטה שתוארה על ידי רמר ואחרים 69 שימשה לבדיקת ביולוגית של יתושים בוגרים מסוג Aedes aegypti באמצעות אצטון כממס. כל EO נבדק בתחילה כנגד יתושים בוגרים מסוג Aedes aegypti בריכוזים של 100 ו-1000 ppm. יש למרוח 2 מ"ל מכל תמיסה מוכנה לפי מספר Whatman. יש למרוח פיסת נייר סינון אחת (גודל 12 x 15 סמ"ר) ולהניח לאצטון להתאדות במשך 10 דקות. נייר סינון שטופל ב-2 מ"ל אצטון בלבד שימש כביקורת. לאחר התאדות האצטון, נייר הסינון המטופל ונייר הסינון הבקרה הוכנסו לצינור גלילי (עומק 10 ס"מ). עשרה יתושים בני 3 עד 4 ימים שאינם ניזונים מדם הועברו לשלוש עותקים מכל ריכוז. בהתבסס על תוצאות הבדיקות המקדימות, נבדקו ריכוזים שונים של שמנים נבחרים. התמותה נרשמה שעה, שעתיים, 3 שעות, 4 שעות, 5 שעות, 6 שעות, 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות לאחר שחרור היתוש. חשב ערכי LC50 לזמני חשיפה של 24 שעות, 48 שעות ו-72 שעות. אם שיעור התמותה של קבוצת הביקורת עולה על 20%, חזור על הבדיקה כולה. באופן דומה, אם שיעור התמותה בקבוצת הביקורת גדול מ-5%, התאם את התוצאות עבור הדגימות שטופלו באמצעות נוסחת אבוט68.
כרומטוגרפיית גז (Agilent 7890A) וספקטרומטריית מסות (Accu TOF GCv, Jeol) בוצעו כדי לנתח את התרכובות המרכיבות את השמנים האתריים שנבחרו. ה-GC צויד בגלאי FID ובעמודה קפילרית (HP5-MS). גז הנשא היה הליום, קצב הזרימה היה 1 מ"ל/דקה. תוכנית ה-GC קובעת את Allium sativum ל- 10:80-1M-8-220-5M-8-270-9M ואת Ocimum Sainttum ל- 10:80-3M-8-200-3M-10-275-1M-5 – 280, עבור נענע 10:80-1M-8-200-5M-8-275-1M-5-280, עבור אקליפטוס 20.60-1M-10-200-3M-30-280, ועבור אדום. עבור אלף שכבות הם 10: 60-1M-8-220-5M-8-270-3M.
התרכובות העיקריות של כל EO זוהו על סמך אחוז השטח שחושב מתוצאות כרומטוגרמת GC וספקטרומטריית מסות (בהתייחס למסד הנתונים של התקנים NIST 70).
שתי התרכובות העיקריות בכל EO נבחרו על סמך תוצאות GC-MS ונרכשו מסיגמא-אלדריץ' בטוהר של 98-99% לצורך ניסויים ביולוגיים נוספים. התרכובות נבדקו ליעילותן כקוטלת זחלים ובקרב בוגרים כנגד Aedes aegypti כמתואר לעיל. קוטלי הזחלים הסינתטיים הנפוצים ביותר, טמפוסאט (סיגמא אולדריץ') ותרופת ה-malathion למבוגרים (סיגמא אולדריץ'), נותחו כדי להשוות את יעילותן עם תרכובות EO נבחרות, בהתאם לאותו הליך.
תערובות בינאריות של תרכובות טרפן נבחרות ותרכובות טרפן בתוספת אורגנופוספטים מסחריים (טילפוס ומלאתיון) הוכנו על ידי ערבוב מינון LC50 של כל תרכובת מועמדת ביחס של 1:1. השילובים שהוכנו נבדקו בשלבי זחל ובוגר של Aedes aegypti כמתואר לעיל. כל ביו-אסאי בוצע בשלושה עותקים עבור כל שילוב ובשלשה עותקים עבור התרכובות הבודדות הקיימות בכל שילוב. מותם של חרקי המטרה תועד לאחר 24 שעות. חשב את שיעור התמותה הצפוי עבור תערובת בינארית באמצעות הנוסחה הבאה.
כאשר E = שיעור התמותה הצפוי של יתושי Aedes aegypti בתגובה לשילוב בינארי, כלומר קשר (A + B).
ההשפעה של כל תערובת בינארית סומנה כסינרגטית, אנטגוניסטית או ללא השפעה בהתבסס על ערך χ2 שחושב בשיטה שתוארה על ידי Pavla52. חשב את ערך χ2 עבור כל שילוב באמצעות הנוסחה הבאה.
ההשפעה של שילוב הוגדרה כסינרגטית כאשר ערך χ2 המחושב היה גדול מערך הטבלה עבור דרגות החופש המתאימות (רווח בר-סמך של 95%) ואם נמצא כי התמותה שנצפתה עולה על התמותה הצפויה. באופן דומה, אם ערך χ2 המחושב עבור שילוב כלשהו עולה על ערך הטבלה עם דרגות חופש מסוימות, אך התמותה שנצפתה נמוכה מהתמותה הצפויה, הטיפול נחשב אנטגוניסטי. ואם בכל שילוב הערך המחושב של χ2 קטן מערך הטבלה בדרגות החופש המתאימות, השילוב נחשב כחסר השפעה.
שלושה עד ארבעה שילובים סינרגטיים פוטנציאליים (100 זחלים ו-50 חרקים בוגרים וקוטלי זחלים) נבחרו לבדיקה כנגד מספר רב של חרקים. חרקים בוגרים) ממשיכים כמפורט לעיל. יחד עם התערובות, תרכובות בודדות הקיימות בתערובות שנבחרו נבדקו גם על מספר שווה של זחלי Aedes aegypti ובוגרים. יחס השילוב הוא חלק אחד של מינון LC50 של תרכובת מועמדת אחת וחלק ממנת LC50 של התרכובת המרכיבה השנייה. בביולוגיית הפעילות של הבוגרים, תרכובות נבחרות הומסו בממס אצטון והוחלו על נייר סינון עטוף במיכל פלסטיק גלילי של 1300 סמ"ק. האצטון התאדה במשך 10 דקות והבוגרים שוחררו. באופן דומה, בביולוגיית הפעילות של הזחלים, מינונים של תרכובות מועמדות LC50 הומסו תחילה בנפחים שווים של DMSO ולאחר מכן עורבבו עם ליטר אחד של מים שאוחסנו במיכלי פלסטיק של 1300 סמ"ק, והזחלים שוחררו.
ניתוח הסתברותי של 71 נתוני תמותה שתועדו בוצע באמצעות SPSS (גרסה 16) ותוכנת Minitab לחישוב ערכי LC50.
זמן פרסום: 1 ביולי 2024