פעילות ביולוגית של אבקת זרעי כרוב ותרכובותיה כקוטל זחל ידידותי לסביבה נגד יתושים

כדי ביעילותלשלוט ביתושיםולהפחית את שכיחות המחלות שהם נושאים, יש צורך בחלופות אסטרטגיות, בר קיימא וידידותיות לסביבה להדברה כימית.הערכנו ארוחות זרעים מ-Brassicaceae מסוימים (משפחת Brassica) כמקור לאיזותיוציאנטים שמקורם בצמחים המיוצרים על ידי הידרוליזה אנזימטית של גלוקוזינולטים לא פעילים ביולוגית לשימוש בשליטה ב-Aedes המצרית (L., 1762).קמח זרעים נטולי שומן (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ו-Thlaspi arvense – שלושה סוגים עיקריים של השבתה תרמית והפחתה אנזימטית כימית. מוצרים לקביעת רעילות (LC50) של אליל איזותיוציאנט, בנזיל איזותיוציאנט ו-4-הידרוקסי-בנזיליזוטיוציאנאט לזחלים של Aedes aegypti בחשיפה של 24 שעות = 0.04 גרם/120 מ"ל dH2O).ערכי LC50 עבור חרדל, חרדל לבן וזנב סוס.קמח זרעים היה 0.05, 0.08 ו-0.05 בהתאמה בהשוואה ל-allyl isothiocyanate (LC50 = 19.35 ppm) ו-4. -Hydroxybenzylisothiocyanate (LC50 = 55.41 ppm) היה רעיל יותר לזחלים ב-24 שעות לאחר הטיפול/120 ml dH בהתאמה.תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם ייצור קמח זרעי אספסת.היעילות הגבוהה יותר של אסטרים בנזילים תואמת את ערכי LC50 המחושבים.שימוש בקמח זרעים יכול לספק שיטה יעילה להדברת יתושים.היעילות של אבקת זרעי מצליבים ומרכיביה הכימיים העיקריים נגד זחלי יתושים ומראה כיצד התרכובות הטבעיות באבקת זרעי המצליבים יכולות לשמש קוטל זחלים ידידותי לסביבה מבטיח להדברת יתושים.
מחלות המועברות על ידי וקטור הנגרמות על ידי יתושי Aedes נותרו בעיה עולמית מרכזית בבריאות הציבור.השכיחות של מחלות הנישאות יתושים מתפשטת גיאוגרפית1,2,3 ומתעוררת מחדש, מה שמוביל להתפרצויות של מחלות קשות4,5,6,7.התפשטות המחלות בקרב בני אדם ובעלי חיים (למשל, צ'יקונגוניה, דנגי, קדחת עמק השבר, קדחת צהובה ונגיף זיקה) היא חסרת תקדים.קדחת דנגי לבדה מציבה כ-3.6 מיליארד בני אדם בסיכון להידבקות באזורים הטרופיים, כאשר לפי הערכות מתרחשים 390 מיליון זיהומים מדי שנה, וכתוצאה מכך 6,100-24,300 מקרי מוות בשנה8.הופעתו מחדש והתפרצותו של נגיף הזיקה בדרום אמריקה משכה תשומת לב עולמית בשל הנזק המוחי שהוא גורם לילדים שנולדו לנשים נגועות2.Kremer et al 3 חוזים כי הטווח הגיאוגרפי של יתושי Aedes ימשיך להתרחב וכי עד שנת 2050, מחצית מאוכלוסיית העולם תהיה בסיכון להידבקות על ידי ארבו-וירוס הנישאים על ידי יתושים.
למעט החיסונים שפותחו לאחרונה נגד דנגי וקדחת צהובה, עדיין לא פותחו חיסונים נגד רוב המחלות הנישאות יתושים9,10,11.חיסונים עדיין זמינים בכמויות מוגבלות ומשמשים רק בניסויים קליניים.שליטה על וקטורי יתושים באמצעות קוטלי חרקים סינתטיים הייתה אסטרטגיית מפתח לשליטה בהתפשטות מחלות הנישאות יתושים12,13.למרות שחומרי הדברה סינתטיים יעילים בהדברת יתושים, המשך השימוש בחומרי הדברה סינתטיים משפיע לרעה על אורגניזמים שאינם מטרה ומזהם את הסביבה14,15,16.מדאיגה אף יותר היא המגמה של הגברת עמידות היתושים לקוטלי חרקים כימיים17,18,19.בעיות אלו הקשורות לחומרי הדברה האיצו את החיפוש אחר חלופות יעילות וידידותיות לסביבה לשליטה על מחוללי מחלות.
צמחים שונים פותחו כמקורות לחומרי הדברה בצמחים להדברה20,21.חומרים צמחיים הם בדרך כלל ידידותיים לסביבה מכיוון שהם מתכלים ביולוגית ובעלי רעילות נמוכה או זניחה לאורגניזמים שאינם מטרה כגון יונקים, דגים ודו-חיים20,22.ידוע כי תכשירים צמחיים מייצרים מגוון תרכובות ביו-אקטיביות עם מנגנוני פעולה שונים לשליטה יעילה בשלבי חיים שונים של יתושים23,24,25,26.תרכובות שמקורן בצמחים כגון שמנים אתריים ומרכיבים צמחיים פעילים אחרים זכו לתשומת לב וסללו את הדרך לכלים חדשניים לשליטה בוקטורים של יתושים.שמנים אתריים, מונוטרפנים וססקוויטרפנים פועלים כדוחים, מונעי האכלה וחומרי עקה27,28,29,30,31,32,33.שמנים צמחיים רבים גורמים למוות של זחלי יתושים, גלמים ומבוגרים34,35,36, ומשפיעים על מערכת העצבים, מערכת הנשימה, האנדוקרינית ומערכות חשובות אחרות של חרקים37.
מחקרים אחרונים סיפקו תובנה לגבי השימוש הפוטנציאלי של צמחי חרדל וזרעים שלהם כמקור לתרכובות ביו-אקטיביות.קמח זרעי חרדל נבדק כחומר ביוחם38,39,40,41 ומשמש כתיקון קרקע לדיכוי עשבים42,43,44 והדברה של פתוגנים צמחיים הנישאים באדמה45,46,47,48,49,50, תזונת צמחים.נמטודות 41,51, 52, 53, 54 ומזיקים 55, 56, 57, 58, 59, 60. הפעילות קוטלית הפטריות של אבקות זרעים אלו מיוחסת לתרכובות הגנה על הצמח הנקראות איזותיוציאנטים38,42,60.בצמחים, תרכובות הגנה אלו מאוחסנות בתאי צמחים בצורה של גלוקוזינולטים שאינם ביו-אקטיביים.עם זאת, כאשר צמחים נפגעים מהאכלת חרקים או זיהום פתוגן, גלוקוזינולטים עוברים הידרוליזה על ידי מירוזינאז לאיזותיוציאנטים ביו-אקטיביים55,61.Isothiocyanates הם תרכובות נדיפות ידועות בעלות טווח רחב של פעילות אנטי-מיקרוביאלית וקוטל חרקים, והמבנה, הפעילות הביולוגית והתכולה שלהן משתנים מאוד בין מיני Brassicaceae42,59,62,63.
למרות שידוע כי איזותיוציאנטים המופקים מקמח זרעי חרדל בעלי פעילות קוטל חרקים, חסרים נתונים על פעילות ביולוגית נגד וקטורים של פרוקי רגליים חשובים מבחינה רפואית.המחקר שלנו בדק את הפעילות קוטל הזחלים של ארבע אבקות זרעים נטולות שומן נגד יתושי Aedes.זחלים של Aedes aegypti.מטרת המחקר הייתה להעריך את השימוש הפוטנציאלי שלהם כחומרי הדברה ביולוגיים ידידותיים לסביבה להדברת יתושים.שלושה מרכיבים כימיים עיקריים של קמח הזרע, אליל איזותיוציאנאט (AITC), בנזיל איזותיוציאנאט (BITC) ו-4-hydroxybenzylisothiocyanate (4-HBITC) נבדקו גם הם כדי לבדוק את הפעילות הביולוגית של רכיבים כימיים אלו על זחלי יתושים.זהו הדו"ח הראשון שמעריך את היעילות של ארבע אבקות זרעי כרוב והמרכיבים הכימיים העיקריים שלהן נגד זחלי יתושים.
מושבות מעבדה של Aedes aegypti (זן רוקפלר) נשמרו על 26 מעלות צלזיוס, 70% לחות יחסית (RH) ו-10:14 שעות (L:D photoperiod).נקבות מזדווגות אוחסנו בכלובי פלסטיק (גובה 11 ס"מ וקוטר 9.5 ס"מ) והוזנו באמצעות מערכת האכלה מבקבוק באמצעות דם בקר בציטרציה (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, ארה"ב).האכלת הדם בוצעה כרגיל באמצעות מזין רב זכוכית ממברנה (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, ארה"ב) המחובר לאמבטיית מים במחזור (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) עם טמפרטורה שליטה ב-37 מעלות צלזיוס.למתוח סרט של Parafilm M על החלק התחתון של כל תא הזנת זכוכית (שטח 154 מ"מ).כל מזין הונח אז על הרשת העליונה המכסה את הכלוב המכיל את הנקבה המזווגת.כ-350-400 μl של דם בקר נוספו למשפך מזין זכוכית באמצעות פיפטת פסטר (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב) והתולעים הבוגרות הורשו להתנקז במשך שעה אחת לפחות.לאחר מכן ניתנה לנקבות הרות תמיסת סוכרוז של 10% והורשה להטיל ביצים על נייר סינון לח מרופד בכוסות סופלה שקופות במיוחד (גודל 1.25 פל אונקיות, Dart Container Corp., Mason, MI, ארה"ב).כלוב עם מים.הניחו נייר סינון המכיל ביצים בשקית אטומה (SC Johnsons, Racine, WI) ואחסנו ב-26 מעלות צלזיוס.הביצים בקעו וכ-200-250 זחלים גידלו במגשי פלסטיק שהכילו תערובת של חמין ארנבים (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, ארה"ב) ואבקת כבד (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, ארה"ב).ופילה דג (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, גרמניה) ביחס של 2:1:1.זחלים בשלב השלישי המאוחר שימשו במבחנים הביולוגיים שלנו.
חומר זרעי צמחים המשמש במחקר זה התקבל מהמקורות המסחריים והממשלתיים הבאים: Brassica juncea (חרדל חום-זהב פסיפיק) ו-Brassica juncea (חרדל לבן-אידה זהב) מקואופרטיב החקלאים של צפון-מערב פסיפיק, מדינת וושינגטון, ארה"ב;(Garden Cress) מ- Kelly Seed and Hardware Co., Peoria, IL, ארה"ב ו-Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) מ-USDA-ARS, Peoria, IL, ארה"ב;אף אחד מהזרעים ששימשו במחקר לא טופל בחומרי הדברה.כל חומר הזרע עובד והשתמש במחקר זה בהתאם לתקנות מקומיות ולאומיות ובהתאמה לכל התקנות המקומיות והלאומיות הרלוונטיות.מחקר זה לא בדק זני צמחים מהונדסים.
זרעי Brassica juncea (PG), אספסת (Ls), חרדל לבן (IG), Thlaspi arvense (DFP) נטחנו לאבקה דקה באמצעות טחנת אולטרה צנטריפוגלית Retsch ZM200 (Retsch, Haan, גרמניה) מצוידת ברשת 0.75 מ"מ ונירוסטה אל חלד. רוטור פלדה, 12 שיניים, 10,000 סל"ד (טבלה 1).אבקת הזרעים הטחונים הועברה לאצבעוני נייר והוסרו בהקסאן במכשיר Soxhlet למשך 24 שעות.תת-דגימה של חרדל שדה נטולי שומן טופלה בחום ב-100 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לדחות את מירוזינאז ולמנוע הידרוליזה של גלוקוזינולטים ליצירת איזותיוציאנטים פעילים ביולוגית.אבקת זרעי זנב סוס שטופלה בחום (DFP-HT) שימשה כבקרה שלילית על ידי דנטורציה של מירוזינאז.
תכולת הגלוקוזינולט של קמח זרעים נטולי שומן נקבעה בשלושה עותקים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) לפי פרוטוקול שפורסם בעבר 64 .בקצרה, 3 מ"ל של מתנול נוספו לדגימה של 250 מ"ג של אבקת זרעים חסרת שומן.כל דגימה עברה קול באמבט מים למשך 30 דקות והושארה בחושך ב-23 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות.מנה של 1 מ"ל מהשכבה האורגנית סונן דרך מסנן 0.45 מיקרומטר לתוך דגימה אוטומטית.פועל על מערכת Shimadzu HPLC (שתי משאבות LC 20AD; דגימה אוטומטית SIL 20A; מסיר גז DGU 20As; גלאי UV-VIS SPD-20A לניטור ב-237 ננומטר; ומודול אפיק תקשורת CBM-20A), נקבעה תכולת הגלוקוזינולט של קמח זרעים בשלושה עותקים .באמצעות תוכנת Shimadzu LC Solution גרסה 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, ארה"ב).העמודה הייתה עמודת C18 Inertsil הפוכה (250 מ"מ × 4.6 מ"מ; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, Torrance, CA, ארה"ב).תנאי השלב הנייד הראשוני נקבעו ל-12% מתנול/88% 0.01 M tetrabutylammonium hydroxide במים (TBAH; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) עם קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה.לאחר הזרקת 15 μl של דגימה, התנאים הראשוניים נשמרו במשך 20 דקות, ולאחר מכן יחס הממס הותאם ל-100% מתנול, עם זמן ניתוח מדגם כולל של 65 דקות.עקומה סטנדרטית (מבוססת nM/mAb) נוצרה על ידי דילול סדרתי של תקני סינפין, גלוקוזינולט ומירוזין שהוכנו טריים (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ארה"ב) כדי להעריך את תכולת הגופרית של קמח זרעים משומנים.גלוקוזינולטים.ריכוזי הגלוקוזינולט בדגימות נבדקו ב-Agilent 1100 HPLC (Agilent, Santa Clara, CA, ארה"ב) באמצעות גרסה OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) המצוידת באותה עמודה ובאמצעות שיטה שתוארה קודם לכן.נקבעו ריכוזי גלוקוזינולט;להיות בר השוואה בין מערכות HPLC.
Allyl isothiocyanate (94%, יציב) ו-benzyl isothiocyanate (98%) נרכשו מ-Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ארה"ב).4-Hydroxybenzylisothiocyanate נרכש מ- ChemCruz (Santa Cruz Biotechnology, CA, ארה"ב).כאשר עוברים הידרוליזה אנזימטית על ידי מירוזינאז, גלוקוזינולטים, גלוקוזינולטים וגלוקוזינולטים יוצרים אליל איזותיוציאנט, בנזיל איזותיוציאנט ו-4-הידרוקסי-בנזיליזוטיוציאנאט, בהתאמה.
בדיקות ביולוגיות מעבדתיות בוצעו לפי השיטה של ​​Muturi וחב'.32 עם שינויים.במחקר נעשה שימוש בחמש הזנות זרעים דלי שומן: DFP, DFP-HT, IG, PG ו-Ls.20 זחלים הונחו בכוס תלת-כיוונית חד פעמית בנפח 400 מ"ל (VWR International, LLC, Radnor, PA, ארה"ב) המכילה 120 מ"ל מים מפושטים (dH2O).שבעה ריכוזי ארוחות זרעים נבדקו עבור רעילות זחלי יתושים: 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 ו-0.12 גרם קמח זרעים/120 מ"ל dH2O עבור קמח זרעים של DFP, DFP-HT, IG ו-PG.מבחני ביולוגיים ראשוניים מצביעים על כך שקמח זרעי Ls נטול שומן רעיל יותר מארבעה קמחי זרעים אחרים שנבדקו.לכן, התאמנו את שבעת ריכוזי הטיפול של קמח זרעי Ls לריכוזים הבאים: 0.015, 0.025, 0.035, 0.045, 0.055, 0.065 ו-0.075 גרם/120 מ"ל dH2O.
קבוצת ביקורת לא מטופלת (dH20, ללא תוסף ארוחה זרעים) נכללה כדי להעריך תמותה תקינה של חרקים בתנאי בדיקה.בדיקות ביולוגיות טוקסיקולוגיות עבור כל ארוחה זרעים כללו שלוש כוסות משוכפלות בעלות שלושה שיפועים (20 זחלים בשלב שלישי מאוחר לכל כוס), בסך הכל 108 בקבוקונים.מיכלים שטופלו אוחסנו בטמפרטורת החדר (20-21 מעלות צלזיוס) ותמותת זחלים נרשמה במהלך 24 ו-72 שעות של חשיפה מתמשכת לריכוזי הטיפול.אם גוף היתוש ותוספי היתוש אינם זזים בעת פירור או מגע עם מרית נירוסטה דקה, זחלי היתושים נחשבים למתים.זחלים מתים בדרך כלל נשארים ללא תנועה במצב גב או גחון בתחתית המיכל או על פני המים.הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים בימים שונים תוך שימוש בקבוצות שונות של זחלים, בסך הכל 180 זחלים שנחשפו לכל ריכוז טיפול.
הרעילות של AITC, BITC ו-4-HBITC לזחלי יתושים הוערכה באמצעות אותו הליך ביולוגי אך עם טיפולים שונים.הכן פתרונות מלאי של 100,000 ppm עבור כל כימיקל על ידי הוספת 100 μL של הכימיקל ל- 900 μL של אתנול מוחלט בצינור צנטריפוגה של 2 מ"ל וניעור במשך 30 שניות כדי לערבב ביסודיות.ריכוזי הטיפול נקבעו על סמך הבדיקות הביולוגיות המקדימות שלנו, שמצאו כי BITC רעיל הרבה יותר מ-AITC ו-4-HBITC.כדי לקבוע רעילות, 5 ריכוזים של BITC (1, 3, 6, 9 ו-12 ppm), 7 ריכוזים של AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 ו-35 ppm) ו-6 ריכוזים של 4-HBITC (15). , 15, 20, 25, 30 ו-35 עמודים לדקה).30, 45, 60, 75 ו-90 עמודים לדקה).לטיפול הביקורת הוזרק 108 μL של אתנול מוחלט, המקביל לנפח המרבי של הטיפול הכימי.בדיקות ביולוגיות חזרו על עצמם כמו לעיל, וחשפו בסך הכל 180 זחלים לכל ריכוז טיפול.תמותה של זחלים נרשמה עבור כל ריכוז של AITC, BITC ו-4-HBITC לאחר 24 שעות של חשיפה מתמשכת.
ניתוח פרוביט של 65 נתוני תמותה הקשורים למינון בוצע באמצעות תוכנת Polo (Polo Plus, LeOra Software, גרסה 1.0) כדי לחשב 50% ריכוז קטלני (LC50), 90% ריכוז קטלני (LC90), שיפוע, מקדם מינון קטלני ו-95 % ריכוז קטלני.מבוסס על רווחי סמך ליחסי מינון קטלניים עבור עקומות ריכוז ומינון-תמותה שעברו טרנספורמציה.נתוני התמותה מבוססים על נתונים משוכפלים משולבים של 180 זחלים שנחשפו לכל ריכוז טיפול.ניתוח הסתברותי בוצע בנפרד עבור כל ארוחת זרעים ולכל רכיב כימי.בהתבסס על רווח הסמך של 95% של יחס המינון הקטלני, הרעילות של קמח זרעים ומרכיבים כימיים לזחלי יתושים נחשבה לשונה באופן מובהק, ולכן רווח סמך המכיל ערך של 1 לא היה שונה באופן מובהק, P = 0.0566.
תוצאות ה-HPLC לקביעת הגלוקוזינולטים העיקריים בקמחי זרעים נטולי שומן DFP, IG, PG ו-Ls מופיעות בטבלה 1. הגלוקוזינולטים העיקריים בקמחי הזרעים שנבדקו השתנו למעט DFP ו-PG, ששניהם הכילו מירוזינאז גלוקוזינולטים.תכולת המירוזינין ב-PG הייתה גבוהה יותר מאשר ב-DFP, 33.3 ± 1.5 ו-26.5 ± 0.9 מ"ג/ג', בהתאמה.אבקת זרעי Ls הכילה 36.6 ± 1.2 מ"ג/גרם גלוקוגליקון, בעוד שאבקת זרעי IG הכילה 38.0 ± 0.5 מ"ג/ג סינפין.
זחלים של Ae.יתושי Aedes aegypti נהרגו כאשר טופלו בקמח זרעים נטולי שומן, אם כי יעילות הטיפול השתנתה בהתאם לסוג הצמח.רק DFP-NT לא היה רעיל לזחלי יתושים לאחר 24 ו-72 שעות של חשיפה (טבלה 2).הרעילות של אבקת הזרעים הפעילה עלתה עם הגדלת הריכוז (איור 1A, B).הרעילות של קמח זרעים לזחלי יתושים השתנתה באופן משמעותי בהתבסס על 95% CI של יחס המינון הקטלני של ערכי LC50 בהערכות של 24 שעות ו-72 שעות (טבלה 3).לאחר 24 שעות, ההשפעה הרעילה של קמח זרעים של Ls הייתה גדולה יותר מטיפולי ארוחות זרעים אחרים, עם הפעילות הגבוהה ביותר והרעילות המקסימלית לזחלים (LC50 = 0.04 גרם/120 מ"ל dH2O).הזחלים היו פחות רגישים ל-DFP ב-24 שעות בהשוואה לטיפולי אבקת זרעים של IG, Ls ו-PG, עם ערכי LC50 של 0.115, 0.04 ו-0.08 גרם/120 מ"ל dH2O בהתאמה, שהיו גבוהים סטטיסטית מערך LC50.0.211 גרם/120 מ"ל dH2O (טבלה 3).ערכי LC90 של DFP, IG, PG ו-Ls היו 0.376, 0.275, 0.137 ו-0.074 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה (טבלה 2).הריכוז הגבוה ביותר של DPP היה 0.12 גרם/120 מ"ל dH2O.לאחר 24 שעות של הערכה, התמותה הממוצעת של הזחלים הייתה רק 12%, בעוד שהתמותה הממוצעת של זחלי IG ו-PG הגיעה ל-51% ו-82%, בהתאמה.לאחר 24 שעות של הערכה, התמותה הממוצעת של הזחלים עבור הריכוז הגבוה ביותר של טיפול בארוחה בזרע Ls (0.075 גרם/120 מ"ל dH2O) הייתה 99% (איור 1A).
עקומות תמותה נאמדו מתגובת המינון (Probit) של Ae.זחלים מצריים (זחלים בשלב 3) עד ריכוז ארוחת זרע 24 שעות (A) ו-72 שעות (B) לאחר הטיפול.הקו המקווקו מייצג את ה-LC50 של הטיפול בארוחה בזרע.DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Heat inactivated Thlaspi arvense, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
בהערכה של 72 שעות, ערכי LC50 של ארוחת זרעים DFP, IG ו-PG היו 0.111, 0.085 ו-0.051 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה.כמעט כל הזחלים שנחשפו לארוחת זרעי Ls מתו לאחר 72 שעות של חשיפה, כך שנתוני התמותה לא היו עולים בקנה אחד עם ניתוח פרוביט.בהשוואה לקמח זרעים אחרים, הזחלים היו פחות רגישים לטיפול בארוחת זרעים של DFP והיו בעלי ערכי LC50 גבוהים יותר סטטיסטית (טבלאות 2 ו-3).לאחר 72 שעות, ערכי LC50 עבור טיפולי ארוחות זרעי DFP, IG ו-PG נאמדו ב-0.111, 0.085 ו-0.05 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה.לאחר 72 שעות של הערכה, ערכי LC90 של אבקות זרעי DFP, IG ו-PG היו 0.215, 0.254 ו-0.138 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה.לאחר 72 שעות של הערכה, התמותה הממוצעת של הזחלים עבור טיפולי זרעי DFP, IG ו-PG בריכוז מרבי של 0.12 גרם/120 מ"ל dH2O הייתה 58%, 66% ו-96%, בהתאמה (איור 1B).לאחר הערכה של 72 שעות, קמח זרעי PG נמצאה רעילה יותר מקמח זרעי IG ו-DFP.
איזותיוציאנטים סינתטיים, אליל איזותיוציאנט (AITC), בנזיל איזותיוציאנט (BITC) ו-4-הידרוקסי-בנזיליזוטיוציאנאט (4-HBITC) יכולים להרוג ביעילות זחלי יתושים.ב-24 שעות לאחר הטיפול, BITC היה רעיל יותר לזחלים עם ערך LC50 של 5.29 ppm בהשוואה ל-19.35 ppm עבור AITC ו-55.41 ppm עבור 4-HBITC (טבלה 4).בהשוואה ל-AITC ו-BITC, ל-4-HBITC יש רעילות נמוכה יותר וערך LC50 גבוה יותר.ישנם הבדלים משמעותיים ברעילות זחלי היתושים של שני האיזוטיוציאנטים העיקריים (Ls ו-PG) בארוחת הזרעים החזקה ביותר.רעילות המבוססת על יחס המינון הקטלני של ערכי LC50 בין AITC, BITC ו-4-HBITC הראתה הבדל סטטיסטי כך ש-95% CI של יחס המינון הקטלני LC50 לא כלל ערך של 1 (P = 0.05, טבלה 4).הריכוזים הגבוהים ביותר של BITC ו-AITC נאמדו להרוג 100% מהזחלים שנבדקו (איור 2).
עקומות תמותה נאמדו מתגובת המינון (Probit) של Ae.24 שעות לאחר הטיפול, הזחלים המצריים (זחלים בשלב 3) הגיעו לריכוזי איזותיוציאנט סינתטי.הקו המקווקו מייצג את ה-LC50 לטיפול באיזוטיוציאנט.Benzyl isothiocyanate BITC, allyl isothiocyanate AITC ו-4-HBITC.
השימוש בחומרי הדברה ביו-צמחים כחומרי הדברה וקטור יתושים נחקר זמן רב.צמחים רבים מייצרים כימיקלים טבעיים בעלי פעילות קוטל חרקים37.התרכובות הביו-אקטיביות שלהם מספקות חלופה אטרקטיבית לקוטלי חרקים סינתטיים עם פוטנציאל רב בהדברת מזיקים, כולל יתושים.
צמחי חרדל גדלים כגידול לזרעיהם, משמשים כתבלין ומקור שמן.כאשר מופק שמן חרדל מהזרעים או כאשר מופק חרדל לשימוש כדלק ביולוגי, 69 תוצר הלוואי הוא קמח זרעים נטולי שומן.ארוחת זרעים זו שומרת על רבים מהרכיבים הביוכימיים הטבעיים ומהאנזימים ההידרוליטיים שלה.הרעילות של קמח זרעים זו מיוחסת לייצור של איזותיוציאנטים55,60,61.Isothiocyanates נוצרים על ידי הידרוליזה של גלוקוזינולטים על ידי האנזים מירוזינאז במהלך הידרציה של קמח זרעים38,55,70 וידועים כבעלי השפעות קוטל פטריות, קוטל חיידקים, נמטיות וקוטל חרקים, כמו גם תכונות אחרות כולל השפעות חושיות כימיות ותכונות כימותרפיות61,62, 70.מספר מחקרים הראו שצמחי חרדל וקמח זרעים פועלים ביעילות כחומרי חיטוי נגד מזיקים באדמה ומזקי מזון מאוחסנים57,59,71,72.במחקר זה, הערכנו את הרעילות של ארוחה עם ארבעה זרעים ושל שלושת המוצרים הביו-אקטיביים שלה AITC, BITC ו-4-HBITC לזחלי יתוש Aedes.Aedes aegypti.הוספת קמח זרעים ישירות למים המכילים זחלי יתושים צפויה להפעיל תהליכים אנזימטיים המייצרים איזותיוציאנטים רעילים לזחלי יתושים.טרנספורמציה ביולוגית זו הוכחה בחלקה על ידי פעילות קוטל הזחלים שנצפתה של ארוחת הזרעים ואובדן פעילות קוטל חרקים כאשר קמח זרעי חרדל ננסי טופלה בחום לפני השימוש.טיפול בחום צפוי להרוס את האנזימים ההידרוליטיים המפעילים גלוקוזינולטים, ובכך למנוע היווצרות של איזותיוציאנטים ביו-אקטיביים.זהו המחקר הראשון שמאשר את תכונות קוטל החרקים של אבקת זרעי כרוב נגד יתושים בסביבה מימית.
בין אבקות הזרעים שנבדקו, אבקת זרעי גרגיר הנחלים (Ls) הייתה הרעילה ביותר, וגרמה לתמותה גבוהה של Aedes albopictus.זחלי Aedes aegypti עובדו ברציפות במשך 24 שעות.לשלושת אבקות הזרעים הנותרות (PG, IG ו-DFP) הייתה פעילות איטית יותר ועדיין גרמו לתמותה משמעותית לאחר 72 שעות של טיפול רצוף.רק ארוחת זרעי Ls הכילה כמויות משמעותיות של גלוקוזינולטים, בעוד ש-PG ו-DFP הכילו מירוזינאז ו-IG הכילו גלוקוזינולט בתור הגלוקוזינולט העיקרי (טבלה 1).Glucotropaeolin עובר הידרוליזה ל-BITC ו-sinalbine עובר הידרוליזה ל-4-HBITC61,62.תוצאות הבדיקה הביולוגית שלנו מצביעות על כך שגם קמח זרעי Ls וגם BITC סינתטי הם רעילים מאוד לזחלי יתושים.המרכיב העיקרי של קמח זרעי PG ו-DFP הוא myrosinase glucosinolate, אשר עובר הידרוליזה ל-AITC.AITC יעיל בהריגת זחלי יתושים עם ערך LC50 של 19.35 ppm.בהשוואה ל-AITC ו-BITC, 4-HBITC isothiocyanate הוא הכי פחות רעיל לזחלים.למרות ש-AITC פחות רעיל מ-BITC, ערכי LC50 שלהם נמוכים משמנים אתריים רבים שנבדקו על זחלי יתושים32,73,74,75.
אבקת זרעי המצליבים שלנו לשימוש נגד זחלי יתושים מכילה גלוקוזינולט מרכזי אחד, המהווה למעלה מ-98-99% מסך הגלוקוזינולטים כפי שנקבע על ידי HPLC.כמויות עקבות של גלוקוזינולטים אחרים זוהו, אך רמותיהם היו פחות מ-0.3% מסך הגלוקוזינולטים.אבקת זרעי גרגיר הנחלים (L. sativum) מכילה גלוקוזינולטים משניים (סיניגרין), אך שיעורם הוא 1% מסך הגלוקוזינולטים, ותכולתם עדיין לא משמעותית (כ-0.4 מ"ג/ג אבקת זרעים).למרות ש-PG ו-DFP מכילים את אותו גלוקוזינולט עיקרי (מירוזין), הפעילות קוטל הזחלים של ארוחות הזרעים שלהם שונה באופן משמעותי עקב ערכי LC50 שלהם.משתנה ברעילות לטחב אבקתי.הופעת זחלי Aedes aegypti עשויה לנבוע מהבדלים בפעילות המירוזינאז או ביציבות בין שני הזרעים.פעילות מירוזינאז ממלאת תפקיד חשוב בזמינות הביולוגית של מוצרי הידרוליזה כגון איזותיוציאנטים בצמחי Brassicaceae76.דיווחים קודמים של Pocock et al.77 ו-Wilkinson et al.78 הראו ששינויים בפעילות ויציבות המירוזינאז עשויים להיות קשורים גם לגורמים גנטיים וסביבתיים.
תכולת האיזוטיוציאנאט הביו-אקטיבית הצפויה חושבה על סמך ערכי LC50 של כל ארוחת זרעים ב-24 ו-72 שעות (טבלה 5) לצורך השוואה עם יישומים כימיים מתאימים.לאחר 24 שעות, האיזותיוציאנטים בארוחת הזרעים היו רעילים יותר מהתרכובות הטהורות.ערכי LC50 שחושבו על בסיס חלקים למיליון (ppm) של טיפולי זרעי איזותיוציאנט היו נמוכים מערכי LC50 עבור יישומי BITC, AITC ו-4-HBITC.צפינו בזחלים צורכים כדורי קמח זרעים (איור 3A).כתוצאה מכך, הזחלים עשויים לקבל חשיפה מרוכזת יותר לאיזותיוציאנטים רעילים על ידי בליעת כדורי קמח זרעים.זה היה ברור ביותר בטיפולי זרעי IG ו-PG בחשיפה של 24 שעות, כאשר ריכוזי LC50 היו נמוכים ב-75% וב-72% מטיפולי AITC טהורים ו-4-HBITC, בהתאמה.טיפולי Ls ו-DFP היו רעילים יותר מאיזוטיוציאנאט טהור, עם ערכי LC50 נמוכים ב-24% ו-41% בהתאמה.הזחלים בטיפול הביקורת התייצבו בהצלחה (איור 3B), בעוד שרוב הזחלים בטיפול בארוחה בזרעים לא התייצבו והתפתחות הזחלים התעכבה משמעותית (איור 3B,D).ב-Spodopteralitura, איזותיוציאנטים קשורים לעיכוב בגדילה ועיכוב התפתחותי79.
זחלים של Ae.יתושי Aedes aegypti נחשפו ברציפות לאבקת זרעי Brassica במשך 24-72 שעות.(א) זחלים מתים עם חלקיקי קמח זרעים בחלקי הפה (בעיגול);(ב) טיפול בקרה (dH20 ללא תוספת קמח זרעים) מראה שהזחלים גדלים כרגיל ומתחילים להתבקע לאחר 72 שעות (C, D) זחלים שטופלו בקמח זרעים;ארוחת הזרעים הראתה הבדלים בהתפתחות ולא התייצבה.
לא חקרנו את מנגנון ההשפעות הרעילות של איזותיוציאנטים על זחלי יתושים.עם זאת, מחקרים קודמים בנמלת אש אדומות (Solenopsis invicta) הראו שעיכוב של גלוטתיון S-transferase (GST) ואסטראז (EST) הוא המנגנון העיקרי של הפעילות הביולוגית של איזוטיוציאנאט, ו-AITC, אפילו בפעילות נמוכה, יכול גם לעכב את פעילות GST .נמלי אש אדומות מיובאות בריכוזים נמוכים.המינון הוא 0.5 מיקרוגרם/מ"ל80.לעומת זאת, AITC מעכב אצטילכולין אסטראז בחדקונית תירס בוגרת (Sitophilus zeamais)81.יש לבצע מחקרים דומים כדי להבהיר את מנגנון פעילות האיזוטיוציאנאט בזחלי יתושים.
אנו משתמשים בטיפול DFP מושבת בחום כדי לתמוך בהצעה לפיה הידרוליזה של גלוקוזינולטים צמחיים ליצירת איזוטיוציאנטים תגובתיים משמשת כמנגנון לבקרת זחלי יתושים על ידי קמח זרעי חרדל.קמח זרעי DFP-HT לא היה רעיל בשיעורי היישום שנבדקו.לאפארגה וחב'.82 דיווחו כי גלוקוזינולטים רגישים לפירוק בטמפרטורות גבוהות.טיפול בחום צפוי גם לסנן את האנזים מירוזינאז בקמח זרעים ולמנוע הידרוליזה של גלוקוזינולטים ליצירת איזותיוציאנטים תגובתיים.זה אושר גם על ידי Okunade et al.75 הראו שמירוזינאז רגיש לטמפרטורה, והראה שפעילות המירוזינאז הושבתה לחלוטין כאשר חרדל, חרדל שחור וזרעי שורש הדם נחשפו לטמפרטורות מעל 80°.ג. מנגנונים אלו עלולים לגרום לאובדן פעילות קוטל חרקים של קמח זרעי DFP שטופלו בחום.
לפיכך, קמח זרעי חרדל ושלושת האיזוטיוציאנטים העיקריים שלו רעילים לזחלי יתושים.בהתחשב בהבדלים אלו בין קמח זרעים לטיפולים כימיים, השימוש בקמח זרעים עשוי להיות שיטה יעילה להדברת יתושים.קיים צורך בזיהוי פורמולציות מתאימות ומערכות אספקה ​​יעילות לשיפור היעילות והיציבות של השימוש באבקות זרעים.התוצאות שלנו מצביעות על שימוש פוטנציאלי בקמח זרעי חרדל כחלופה לחומרי הדברה סינתטיים.טכנולוגיה זו יכולה להפוך לכלי חדשני לשליטה בוקטורים של יתושים.מכיוון שזחלי יתושים משגשגים בסביבות מימיות וגלוקוזינולטים מארוחת זרעים הופכים אנזימטית לאיזותיוציאנטים פעילים לאחר הידרציה, השימוש בקמח זרעי חרדל במים נגועים ביתושים מציע פוטנציאל בקרה משמעותי.למרות שהפעילות קוטל הזחלים של isothiocyanates משתנה (BITC > AITC > 4-HBITC), יש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע אם שילוב של קמח זרעים עם מספר גלוקוזינולטים מגביר באופן סינרגטי את הרעילות.זהו המחקר הראשון שהדגים את ההשפעות קוטלי החרקים של קמח זרעי מצליבים נטולי שומן ושלושה איזוטיוציאנטים ביו-אקטיביים על יתושים.התוצאות של מחקר זה פורצות דרך כשהן מראות כי קמח זרעי כרוב משומנים, תוצר לוואי של מיצוי שמן מהזרעים, עשוי לשמש כחומר קוטל זחלים מבטיח להדברת יתושים.מידע זה יכול לעזור לקדם את הגילוי של סוכני בקרה ביולוגית צמחים ופיתוחם כחומרי הדברה זולים, מעשיים וידידותיים לסביבה.
מערכי הנתונים שנוצרו עבור מחקר זה והניתוחים המתקבלים זמינים מהמחבר המקביל לפי בקשה סבירה.בתום המחקר הושמדו כל החומרים ששימשו במחקר (חרקים וקמח זרעים).