פעילות ביולוגית של אבקת זרעי כרוב ותרכובותיו כקוטל זחלים ידידותי לסביבה נגד יתושים

כדי ביעילותלשלוט יתושיםולהפחית את שכיחות המחלות שהם נושאים, יש צורך בחלופות אסטרטגיות, בנות-קיימא וידידותיות לסביבה לחומרי הדברה כימיים. הערכנו קמח זרעים ממשפחת המלבנים (Brassicaceae) מסוימים כמקור לאיזותיוציאנטים שמקורם בצמחים המיוצרים על ידי הידרוליזה אנזימטית של גלוקוזינולטים לא פעילים ביולוגית לשימוש בהדברת צמחי מרפא (Eedes Emberian) (L., 1762). קמח זרעים מנופה בחמישה שומנים (Brassica juncea (L) Czern., 1859, Lepidium sativum L., 1753, Sinapis alba L., 1753, Thlaspi arvense L., 1753 ו-Thlaspi arvense – שלושה סוגים עיקריים של השבתה תרמית ופירוק אנזימטי. מוצרים כימיים: קביעת הרעילות (LC50) של אליל איזותיוציאנט, בנזיל איזותיוציאנט ו-4-הידרוקסי-בנזילאיזותיוציאנט לזחלי Aedes aegypti בחשיפה של 24 שעות = 0.04 גרם/120 מ"ל dH2O). ערכי LC50 לחרדל, חרדל לבן ובזנב הסוס. קמח זרעים היה 0.05, 0.08 ו-0.05 בהתאמה בהשוואה לאליל איזותיוציאנט (LC50 = 19.35 ppm) ו-4. הידרוקסי-בנזילאיזותיוציאנט (LC50 = 55.41 ppm) היה רעיל יותר לזחלים 24 שעות לאחר הטיפול מאשר 0.1 גרם/120 מ"ל dH2O בהתאמה. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם ייצור קמח זרעי אספסת. היעילות הגבוהה יותר של אסטרים בנזיליים תואמת את ערכי ה-LC50 המחושבים. שימוש בקמח זרעים יכול לספק שיטה יעילה להדברת יתושים. בוחן את יעילות אבקת זרעי המצליבים ואת מרכיביה הכימיים העיקריים כנגד זחלי יתושים ומראה כיצד התרכובות הטבעיות באבקת זרעי המצליבים יכולות לשמש כקוטל זחלים מבטיח וידידותי לסביבה להדברת יתושים.
מחלות המועברות על ידי יתושי Aedes נותרות בעיה מרכזית בבריאות הציבור העולמית. שכיחות המחלות המועברות על ידי יתושים מתפשטת גיאוגרפית1,2,3 וחוזרת על עצמה, מה שמוביל להתפרצויות של מחלות קשות4,5,6,7. התפשטות המחלות בקרב בני אדם ובעלי חיים (למשל, צ'יקונגוניה, קדחת דנגי, קדחת ריפט ואלי, קדחת צהובה ונגיף זיקה) היא חסרת תקדים. קדחת דנגי לבדה מעמידה כ-3.6 מיליארד בני אדם בסיכון להידבקות באזורים הטרופיים, עם כ-390 מיליון הדבקות המתרחשות מדי שנה, וכתוצאה מכך 6,100-24,300 מקרי מוות בשנה8. הופעתו המחודשת והתפרצותו של נגיף זיקה בדרום אמריקה משכו תשומת לב עולמית עקב הנזק המוחי שהוא גורם בילדים שנולדו לנשים נגועות2. קרמר ועמיתיו3 צופים כי הטווח הגיאוגרפי של יתושי Aedes ימשיך להתרחב וכי עד 2050, מחצית מאוכלוסיית העולם תהיה בסיכון להידבקות על ידי ארבו-וירוסים המועברות על ידי יתושים.
למעט החיסונים שפותחו לאחרונה נגד קדחת דנגי וקדחת צהובה, חיסונים נגד רוב המחלות המועברות על ידי יתושים טרם פותחו9,10,11. חיסונים עדיין זמינים בכמויות מוגבלות ומשמשים רק בניסויים קליניים. הדברת וקטורי יתושים באמצעות קוטלי חרקים סינתטיים הייתה אסטרטגיה מרכזית לשליטה בהתפשטות מחלות המועברות על ידי יתושים12,13. למרות שחומרי הדברה סינתטיים יעילים בהריגת יתושים, המשך השימוש בחומרי הדברה סינתטיים משפיע לרעה על אורגניזמים שאינם מטרה ומזהם את הסביבה14,15,16. מדאיגה עוד יותר היא המגמה של עלייה בעמידותם של יתושים לקוטלי חרקים כימיים17,18,19. בעיות אלו הקשורות לחומרי הדברה האיצו את החיפוש אחר חלופות יעילות וידידותיות לסביבה לשליטה בווקטורי מחלות.
צמחים שונים פותחו כמקורות לפיטוקוטלי מזיקים להדברת מזיקים20,21. חומרים צמחיים הם בדרך כלל ידידותיים לסביבה מכיוון שהם מתכלים ביולוגית ובעלי רעילות נמוכה או זניחה לאורגניזמים שאינם מטרה כמו יונקים, דגים ודו-חיים20,22. תכשירים צמחיים ידועים כייצורים של מגוון תרכובות ביו-אקטיביות בעלות מנגנוני פעולה שונים לשליטה יעילה בשלבי חיים שונים של יתושים23,24,25,26. תרכובות שמקורן בצמחים כמו שמנים אתריים ומרכיבים צמחיים פעילים אחרים זכו לתשומת לב וסללו את הדרך לכלים חדשניים לשליטה בוקטורים של יתושים. שמנים אתריים, מונוטרפנים וססקיטרפנים פועלים כדוחים, מרתיעים הזנה וקוטלי ביצים27,28,29,30,31,32,33. שמנים צמחיים רבים גורמים למוות של זחלי יתושים, גלמים ובוגרים34,35,36, ומשפיעים על מערכות העצבים, הנשימה, האנדוקריניות ומערכות חשובות אחרות של חרקים37.
מחקרים אחרונים סיפקו תובנות לגבי השימוש הפוטנציאלי בצמחי חרדל ובזרעיהם כמקור לתרכובות ביו-אקטיביות. קמח זרעי חרדל נבדק כחומר ביולוגי לחומר אידוי38,39,40,41 ושימש כתיקון קרקע לדיכוי עשבים שוטים42,43,44 ולשליטה בפתוגנים צמחיים הנישאים בקרקע45,46,47,48,49,50, תזונת צמחים, נמטודות 41,51, 52, 53, 54 ומזיקים 55, 56, 57, 58, 59, 60. הפעילות הפטרייתית של אבקות זרעים אלו מיוחסת לתרכובות מגנות צמחיות הנקראות איזותיוציאנטים38,42,60. בצמחים, תרכובות מגנות אלו מאוחסנות בתאי צמחים בצורה של גלוקוזינולטים לא ביו-אקטיביים. עם זאת, כאשר צמחים ניזוקים כתוצאה מהזנת חרקים או זיהום פתוגנים, גלוקוזינולטים עוברים הידרוליזה על ידי מירוזינאז לאיזותיוציאנטים ביו-אקטיביים55,61. איזותיוציאנטים הם תרכובות נדיפות הידועות כבעלות פעילות רחבת טווח נגד מיקרוביאלית וקוטלת חרקים, והמבנה, הפעילות הביולוגית ותכולתן משתנים במידה רבה בין מיני כרוביים שונים42,59,62,63.
למרות שידוע כי איזותיוציאנטים שמקורם בקמח זרעי חרדל הם בעלי פעילות קוטלי חרקים, חסרים נתונים על פעילות ביולוגית כנגד וקטורים רפואיים בעלי חשיבות גבוהה של פרוקי רגליים. המחקר שלנו בחן את הפעילות הקוטלת זחלים של ארבע אבקות זרעים מנופות שומן כנגד יתושי Aedes. זחלי Aedes aegypti. מטרת המחקר הייתה להעריך את השימוש הפוטנציאלי שלהם כקוטלי חרקים ביולוגיים ידידותיים לסביבה להדברת יתושים. שלושה רכיבים כימיים עיקריים של קמח הזרעים, אליל איזותיוציאנט (AITC), בנזיל איזותיוציאנט (BITC) ו-4-הידרוקסי-בנזילאיזותיוציאנט (4-HBITC), נבדקו גם הם כדי לבחון את הפעילות הביולוגית של רכיבים כימיים אלה על זחלי יתושים. זהו הדו"ח הראשון שמעריך את יעילותן של ארבע אבקות זרעי כרוב ואת רכיביהן הכימיים העיקריים כנגד זחלי יתושים.
מושבות מעבדה של Aedes aegypti (זן רוקפלר) נשמרו בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס, 70% לחות יחסית (RH) ובזמן צילום של 10:14 שעות (L:D). נקבות מזדווגות שוכנו בכלובים מפלסטיק (גובה 11 ס"מ וקוטר 9.5 ס"מ) והוזנו באמצעות מערכת הזנה בבקבוק תוך שימוש בדם בקר ציטרטי (HemoStat Laboratories Inc., Dixon, CA, USA). הזנת הדם בוצעה כרגיל באמצעות מזין זכוכית רב-ממברנלי (Chemglass, Life Sciences LLC, Vineland, NJ, USA) המחובר לצינור אמבט מים במחזור (HAAKE S7, Thermo-Scientific, Waltham, MA, USA) עם בקרת טמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. מתחו סרט של Parafilm M על תחתית כל תא הזנה מזכוכית (שטח 154 מ"מ²). לאחר מכן, כל מזין הונח על הרשת העליונה המכסה את הכלוב המכיל את הנקבה המזדווגת. כ-350-400 מיקרוליטר של דם בקר נוספו למשפך הזכוכית באמצעות פיפטה פסטר (Fisherbrand, Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) והתולעים הבוגרות הורשו להתנקז למשך שעה לפחות. לאחר מכן ניתנה לנקבות ההרות תמיסת סוכרוז 10% והורשו להטיל ביצים על נייר סינון לח מרופד בכלוב עם מים. הניחו את נייר הסינון המכיל את הביצים בשקית אטומה (SC Johnsons, Racine, WI) ואחסנו בטמפרטורה של 26 מעלות צלזיוס. הביצים בקעו וכ-200-250 זחלים גודלו במגשי פלסטיק המכילים תערובת של מזון ארנבות (ZuPreem, Premium Natural Products, Inc., Mission, KS, USA) ואבקת כבד (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, USA) ופילה דג (TetraMin, Tetra GMPH, Meer, Germany) ביחס של 2:1:1. זחלי אינסטאר שלישי מאוחרים שימשו בבדיקות הביו-ניסוי שלנו.
חומר זרעי הצמחים ששימש במחקר זה התקבל מהמקורות המסחריים והממשלתיים הבאים: Brassica juncea (חרדל חום-Pacific Gold) ו-Brassica juncea (חרדל לבן-Ida Gold) מקואופרטיב החקלאים של צפון מערב האוקיינוס ​​השקט, מדינת וושינגטון, ארה"ב; (Garden Cress) מחברת Kelly Seed and Hardware Co., פאוריה, אילינוי, ארה"ב ו-Thlaspi arvense (Field Pennycress-Elisabeth) מחברת USDA-ARS, פאוריה, אילינוי, ארה"ב; אף אחד מהזרעים ששימשו במחקר לא טופל בחומרי הדברה. כל חומר הזרעים עובד ונעשה בו שימוש במחקר זה בהתאם לתקנות המקומיות והארציות ובהתאם לכל התקנות המקומיות והמדינתיות הרלוונטיות. מחקר זה לא בחן זני צמחים טרנסגניים.
זרעי Brassica juncea (PG), Alfalfa (Ls), White Cheese (IG) ו-Thlaspi arvense (DFP) נטחנו לאבקה דקה באמצעות מטחנה אולטרה-צנטריפוגלית Retsch ZM200 (Retsch, Haan, גרמניה) המצוידת ברשת של 0.75 מ"מ וברוטור מפלדת אל-חלד, 12 שיניים, 10,000 סל"ד (טבלה 1). אבקת הזרעים הטחונה הועברה לאצבעון נייר ונוקה משומן באמצעות הקסאן במכשיר Soxhlet למשך 24 שעות. תת-דגימה של חרדל שדה מנוקה משומן טופלה בחום ב-100 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לפצח את מירוזינאז ולמנוע הידרוליזה של גלוקוזינולטים ליצירת איזותיוציאנטים פעילים ביולוגית. אבקת זרעי זנב horsetail שטופלה בחום (DFP-HT) שימשה כביקורת שלילית על ידי לפצח את מירוזינאז.
תכולת הגלוקוזינולט של קמח זרעים נטול שומן נקבעה בשלושה עותקים באמצעות כרומטוגרפיית נוזלים בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) בהתאם לפרוטוקול שפורסם בעבר 64. בקצרה, 3 מ"ל של מתנול נוספו לדגימה של 250 מ"ג של אבקת זרעים נטולת שומן. כל דגימה עברה סוניקציה באמבט מים למשך 30 דקות והושארה בחושך ב-23 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. לאחר מכן, חלק של 1 מ"ל מהשכבה האורגנית סונן דרך פילטר של 0.45 מיקרון לתוך דוגם אוטומטי. באמצעות מערכת HPLC של Shimadzu (שתי משאבות LC 20AD; דוגם אוטומטי SIL 20A; מסיר גזים DGU 20As; גלאי UV-VIS SPD-20A לניטור ב-237 ננומטר; ומודול אפיק תקשורת CBM-20A), תכולת הגלוקוזינולט של קמח הזרעים נקבעה בשלושה עותקים באמצעות תוכנת Shimadzu LC Solution גרסה 1.25 (Shimadzu Corporation, Columbia, MD, USA). העמודה הייתה עמודת פאזה הפוכה מדגם C18 Inertsil (250 מ"מ × 4.6 מ"מ; RP C-18, ODS-3, 5u; GL Sciences, טורנס, קליפורניה, ארה"ב). תנאי הפאזה הניידת ההתחלתיים נקבעו על 12% מתנול/88% 0.01 M טטרהבוטיל אמוניום הידרוקסיד במים (TBAH; Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) עם קצב זרימה של 1 מ"ל/דקה. לאחר הזרקה של 15 מיקרוליטר של דגימה, התנאים ההתחלתיים נשמרו למשך 20 דקות, ולאחר מכן יחס הממס הותאם ל-100% מתנול, עם זמן ניתוח כולל של 65 דקות לדגימה. עקומת תקן (מבוססת nM/mAb) נוצרה על ידי דילולים סדרתיים של סטנדרטים טריים של סינפין, גלוקוזינולט ומירוזין (Sigma-Aldrich, סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב) כדי להעריך את תכולת הגופרית של גלוקוזינולטים נטולים בזרעי קמח. ריכוזי הגלוקוזינולט בדגימות נבדקו במכשיר Agilent 1100 HPLC (Agilent, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב) באמצעות גרסת OpenLAB CDS ChemStation (C.01.07 SR2 [255]) המצוידת באותה עמודה ותוך שימוש בשיטה שתוארה קודם לכן. ריכוזי הגלוקוזינולט נקבעו; ניתן להשוות בין מערכות HPLC.
אליל איזותיוציאנט (94%, יציב) ובנזיל איזותיוציאנט (98%) נרכשו מחברת Fisher Scientific (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). 4-הידרוקסיבנזילאיזותיוציאנט נרכש מחברת ChemCruz (סנטה קרוז ביוטכנולוגיה, קליפורניה, USA). כאשר גלוקוזינולטים, גלוקוזינולטים וגלוקוזינולטים עוברים הידרוליזה אנזימטית על ידי מירוזינאז, הם יוצרים אליל איזותיוציאנט, בנזיל איזותיוציאנט ו-4-הידרוקסיבנזילאיזותיוציאנט, בהתאמה.
בדיקות ביולוגיות מעבדה בוצעו לפי שיטת Muturi ואחרים 32 עם שינויים. במחקר נעשה שימוש בחמישה סוגי מזון לזרעים דלי שומן: DFP, DFP-HT, IG, PG ו-Ls. עשרים זחלים הונחו בכוס משולשת חד פעמית בנפח 400 מ"ל (VWR International, LLC, Radnor, PA, USA) המכילה 120 מ"ל מים מזוקקים (dH2O). נבדקו שבעה ריכוזי קמח זרעים לרעילות זחלי יתושים: 0.01, 0.02, 0.04, 0.06, 0.08, 0.1 ו-0.12 גרם קמח זרעים/120 מ"ל dH2O עבור קמח זרעים DFP, DFP-HT, IG ו-PG. בדיקות ביולוגיות ראשוניות מצביעות על כך שקמח זרעי Ls נטול שומן רעיל יותר מארבעה קמחי זרעים אחרים שנבדקו. לכן, התאמנו את שבעת ריכוזי הטיפול של קמח זרעי Ls לריכוזים הבאים: 0.015, 0.025, 0.035, 0.045, 0.055, 0.065 ו-0.075 גרם/120 מ"ל dH2O.
קבוצת ביקורת שלא טופלה (dH20, ללא תוספת קמח זרעים) נכללה כדי להעריך את תמותת החרקים התקינה בתנאי הניסוי. מבחני טוקסיקולוגיה עבור כל קמח זרעים כללו שלושה כוסות חוזרות בעלות שלושה שיפועים (20 זחלים בשלב השלישי המאוחר בכל כוס), עבור סך של 108 בקבוקונים. המיכלים המטופלים אוחסנו בטמפרטורת החדר (20-21°C) ותמותת הזחלים נרשמה במהלך 24 ו-72 שעות של חשיפה רציפה לריכוזי טיפול. אם גוף היתוש וגפיו אינם זזים כאשר דוקרים או נוגעים בו עם מרית דקה מפלדת אל-חלד, זחלי היתוש נחשבים מתים. זחלים מתים בדרך כלל נשארים ללא תנועה בתנוחה גבלית או גחונית בתחתית המיכל או על פני המים. הניסוי חזר על עצמו שלוש פעמים בימים שונים תוך שימוש בקבוצות שונות של זחלים, עבור סך של 180 זחלים שנחשפו לכל ריכוז טיפול.
הרעילות של AITC, BITC ו-4-HBITC לזחלי יתושים הוערכה באמצעות אותו הליך ביו-אסאי אך עם טיפולים שונים. הכינו תמיסות מלאי של 100,000 ppm עבור כל כימיקל על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של הכימיקל ל-900 מיקרוליטר של אתנול מוחלט במבחנת צנטריפוגה של 2 מ"ל וניעור במשך 30 שניות לערבוב יסודי. ריכוזי הטיפול נקבעו על סמך הבדיקות הביולוגיות המקדימות שלנו, שמצאו ש-BITC רעיל בהרבה מ-AITC ו-4-HBITC. כדי לקבוע את הרעילות, נלקחו 5 ריכוזים של BITC (1, 3, 6, 9 ו-12 ppm), 7 ריכוזים של AITC (5, 10, 15, 20, 25, 30 ו-35 ppm) ו-6 ריכוזים של 4-HBITC (15, 15, 20, 25, 30 ו-35 ppm). 30, 45, 60, 75 ו-90 ppm). לטיפול הבקרה הוזרק 108 מיקרוליטר של אתנול מוחלט, השווה ערך לנפח המקסימלי של הטיפול הכימי. בדיקות ביולוגיות חזרו על עצמן כנ"ל, וחשפו סך של 180 זחלים לכל ריכוז טיפול. תמותת הזחלים נרשמה עבור כל ריכוז של AITC, BITC ו-4-HBITC לאחר 24 שעות של חשיפה רציפה.
ניתוח פרוביט של 65 נתוני תמותה הקשורים למינון בוצע באמצעות תוכנת Polo (Polo Plus, LeOra Software, גרסה 1.0) כדי לחשב ריכוז קטלני של 50% (LC50), ריכוז קטלני של 90% (LC90), שיפוע, מקדם מינון קטלני וריכוז קטלני של 95%. ניתוח זה מבוסס על רווחי סמך עבור יחסי מינון קטלני עבור עקומות ריכוז ומינון-תמותה שעברו טרנספורמציה לוגריתמית. נתוני התמותה מבוססים על נתוני משולבים של 180 זחלים שנחשפו לכל ריכוז טיפול. ניתוחים הסתברותיים בוצעו בנפרד עבור כל קמח זרעים וכל רכיב כימי. בהתבסס על רווח סמך של 95% של יחס המינון הקטלני, הרעילות של קמח הזרעים והמרכיבים הכימיים לזחלי יתושים נחשבה כשונה באופן משמעותי, כך שטווח סמך המכיל ערך של 1 לא היה שונה באופן משמעותי, P = 0.0566.
תוצאות ה-HPLC לקביעת הגלוקוזינולטים העיקריים בקמחי זרעים נטולי שומן DFP, IG, PG ו-Ls מפורטות בטבלה 1. הגלוקוזינולטים העיקריים בקמחי הזרעים שנבדקו השתנו למעט DFP ו-PG, ששניהם הכילו גלוקוזינולטים של מירוזינאז. תכולת המירוזינין ב-PG הייתה גבוהה יותר מאשר ב-DFP, 33.3 ± 1.5 ו-26.5 ± 0.9 מ"ג/גרם, בהתאמה. אבקת זרעי Ls הכילה 36.6 ± 1.2 מ"ג/גרם גלוקוגליקון, בעוד שאבקת זרעי IG הכילה 38.0 ± 0.5 מ"ג/גרם סינפין.
זחלי יתושי Aedes aegegypti נהרגו כאשר טופלו בקמח זרעים נטול שומן, אם כי יעילות הטיפול השתנתה בהתאם למין הצמח. רק DFP-NT לא היה רעיל לזחלי יתושים לאחר 24 ו-72 שעות של חשיפה (טבלה 2). רעילות אבקת הזרעים הפעילה גדלה עם עליית הריכוז (איור 1A, B). רעילות קמח הזרעים לזחלי יתושים השתנתה באופן משמעותי בהתבסס על רווח בר-סמך 95% של יחס המינון הקטלני של ערכי LC50 בהערכות של 24 שעות ו-72 שעות (טבלה 3). לאחר 24 שעות, ההשפעה הרעילה של קמח זרעי Ls הייתה גדולה יותר מטיפולי קמח זרעים אחרים, עם הפעילות הגבוהה ביותר והרעילות המקסימלית לזחלים (LC50 = 0.04 גרם/120 מ"ל dH2O). הזחלים היו פחות רגישים ל-DFP לאחר 24 שעות בהשוואה לטיפולים באבקת זרעי IG, Ls ו-PG, עם ערכי LC50 של 0.115, 0.04 ו-0.08 גרם/120 מ"ל dH2O בהתאמה, שהיו גבוהים סטטיסטית מערך ה-LC50 של 0.211 גרם/120 מ"ל dH2O (טבלה 3). ערכי LC90 של DFP, IG, PG ו-Ls היו 0.376, 0.275, 0.137 ו-0.074 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה (טבלה 2). הריכוז הגבוה ביותר של DPP היה 0.12 גרם/120 מ"ל dH2O. לאחר 24 שעות של הערכה, תמותת הזחלים הממוצעת הייתה רק 12%, בעוד שהתמותה הממוצעת של זחלי IG ו-PG הגיעה ל-51% ו-82%, בהתאמה. לאחר 24 שעות של הערכה, שיעור התמותה הממוצע של הזחלים עבור טיפול בקמח זרעי Ls בריכוז הגבוה ביותר (0.075 גרם/120 מ"ל dH2O) היה 99% (איור 1A).
עקומות התמותה הוערכו מתגובת המינון (Probit) של זחלי Ae. מצרים (זחלי אינסטאר שלישי) לריכוז קמח זרעים 24 שעות (A) ו-72 שעות (B) לאחר הטיפול. הקו המקווקו מייצג את LC50 של טיפול קמח הזרעים. DFP Thlaspi arvense, DFP-HT Thlaspi arvense מומת בחום, IG Sinapsis alba (Ida Gold), PG Brassica juncea (Pacific Gold), Ls Lepidium sativum.
בהערכה של 72 שעות, ערכי LC50 של קמח זרעים DFP, IG ו-PG היו 0.111, 0.085 ו-0.051 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה. כמעט כל הזחלים שנחשפו לקמח זרעים Ls מתו לאחר 72 שעות של חשיפה, כך שנתוני התמותה לא היו עקביים עם ניתוח Probit. בהשוואה לקמח זרעים אחר, הזחלים היו פחות רגישים לטיפול בקמח זרעים DFP והיו בעלי ערכי LC50 גבוהים יותר סטטיסטית (טבלאות 2 ו-3). לאחר 72 שעות, ערכי LC50 עבור טיפולי קמח זרעים DFP, IG ו-PG הוערכו כ-0.111, 0.085 ו-0.05 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה. לאחר 72 שעות של הערכה, ערכי LC90 של אבקות זרעים DFP, IG ו-PG היו 0.215, 0.254 ו-0.138 גרם/120 מ"ל dH2O, בהתאמה. לאחר 72 שעות של הערכה, שיעור התמותה הממוצע של הזחלים בטיפולי קמח זרעים DFP, IG ו-PG בריכוז מקסימלי של 0.12 גרם/120 מ"ל dH2O היה 58%, 66% ו-96%, בהתאמה (איור 1B). לאחר הערכה של 72 שעות, נמצא שקמח זרעים PG היה רעיל יותר מקמח זרעים IG ו-DFP.
איזותיוציאנטים סינתטיים, אליל איזותיוציאנט (AITC), בנזיל איזותיוציאנט (BITC) ו-4-הידרוקסי-בנזילאיזותיוציאנט (4-HBITC) יכולים להרוג ביעילות זחלי יתושים. 24 שעות לאחר הטיפול, BITC היה רעיל יותר לזחלים עם ערך LC50 של 5.29 ppm בהשוואה ל-19.35 ppm עבור AITC ו-55.41 ppm עבור 4-HBITC (טבלה 4). בהשוואה ל-AITC ו-BITC, ל-4-HBITC רעילות נמוכה יותר וערך LC50 גבוה יותר. ישנם הבדלים משמעותיים ברעילות זחלי היתושים של שני האיזותיוציאנטים העיקריים (Ls ו-PG) בקמח הזרעים החזק ביותר. רעילות המבוססת על יחס מינון קטלני של ערכי LC50 בין AITC, BITC ו-4-HBITC הראתה הבדל סטטיסטי כך שרווח בר-סמך 95% של יחס מינון קטלני LC50 לא כלל ערך של 1 (P = 0.05, טבלה 4). הריכוזים הגבוהים ביותר של BITC ו-AITC הוערכו ככאלה שהרגו 100% מהזחלים שנבדקו (איור 2).
עקומות התמותה הוערכו מתגובת המינון (Probit) של Ae. 24 שעות לאחר הטיפול, זחלים מצריים (זחלים בשלב השלישי) הגיעו לריכוזי איזותיוציאנט סינתטיים. הקו המקווקו מייצג את LC50 לטיפול באיזותיוציאנט. בנזיל איזותיוציאנט BITC, אליל איזותיוציאנט AITC ו-4-HBITC.
השימוש בחומרי הדברה ביולוגיים לצמחים כחומרי הדברה נגד יתושים נחקר זה מכבר. צמחים רבים מייצרים כימיקלים טבעיים בעלי פעילות קוטלת חרקים37. התרכובות הביו-אקטיביות שלהם מספקות אלטרנטיבה אטרקטיבית לקוטלי חרקים סינתטיים עם פוטנציאל גדול בשליטה במזיקים, כולל יתושים.
צמחי חרדל גדלים כגידול לזרעיהם, ומשמשים כתבלין ומקור לשמן. כאשר שמן חרדל מופק מהזרעים או כאשר חרדל מופק לשימוש כדלק ביולוגי, 69 התוצר הלוואי הוא קמח זרעים נטול שומן. קמח זרעים זה שומר על רבים מהמרכיבים הביוכימיים הטבעיים שלו ואנזימים הידרוליטיים. הרעילות של קמח זרעים זה מיוחסת לייצור איזותיוציאנטים 55,60,61. איזותיוציאנטים נוצרים על ידי הידרוליזה של גלוקוזינולטים על ידי האנזים מירוזינאז במהלך הידרציה של קמח זרעים 38,55,70 וידועים כבעלי השפעות פטרייתיות, חיידקיות, נמטידליות וחרקים, כמו גם תכונות אחרות, כולל השפעות חושיות כימיות ותכונות כימותרפיות 61,62,70. מספר מחקרים הראו שצמחי חרדל וקמח זרעים פועלים ביעילות כחומרי חיטוי נגד מזיקים בקרקע ובמזון מאוחסן 57,59,71,72. במחקר זה, הערכנו את הרעילות של קמח ארבעת הזרעים ושלושת התוצרים הביו-אקטיביים שלו AITC, BITC ו-4-HBITC לזחלי יתושים מסוג Aedes. Aedes aegypti. הוספת קמח זרעים ישירות למים המכילים זחלי יתושים צפויה להפעיל תהליכים אנזימטיים המייצרים איזותיוציאנטים רעילים לזחלי יתושים. ביוטרנספורמציה זו הודגמה בחלקה על ידי הפעילות הקוטלת הזחלים שנצפתה של קמח הזרעים ואובדן הפעילות הקוטלת חרקים כאשר קמח זרעי חרדל ננסי טופלו בחום לפני השימוש. טיפול בחום צפוי להשמיד את האנזימים ההידרוליטיים המפעילים גלוקוזינולטים, ובכך למנוע היווצרות של איזותיוציאנטים ביו-אקטיביים. זהו המחקר הראשון המאשר את התכונות הקוטליות של אבקת זרעי כרוב כנגד יתושים בסביבה מימית.
מבין אבקות הזרעים שנבדקו, אבקת זרעי גרגר הנחלים (Ls) הייתה הרעילה ביותר, וגרמה לתמותה גבוהה של Aedes albopictus. זחלי Aedes aegypti עובדו ברציפות במשך 24 שעות. שלוש אבקות הזרעים הנותרות (PG, IG ו-DFP) היו בעלות פעילות איטית יותר ועדיין גרמו לתמותה משמעותית לאחר 72 שעות של טיפול רציף. רק קמח זרעי Ls הכיל כמויות משמעותיות של גלוקוזינולטים, בעוד ש-PG ו-DFP הכילו מירוזינאז ו-IG הכיל גלוקוזינולט כגלוקוזינולט העיקרי (טבלה 1). גלוקוטרופאולין עובר הידרוליזה ל-BITC וסינאלבין עובר הידרוליזה ל-4-HBITC61,62. תוצאות הביו-אסיי שלנו מצביעות על כך שגם קמח זרעי Ls וגם BITC סינתטי רעילים ביותר לזחלי יתושים. המרכיב העיקרי של קמח זרעי PG ו-DFP הוא מירוזינאז גלוקוזינולט, אשר עובר הידרוליזה ל-AITC. AITC יעיל בהריגת זחלי יתושים עם ערך LC50 של 19.35 ppm. בהשוואה ל-AITC ו-BITC, איזותיוציאנט 4-HBITC הוא הפחות רעיל לזחלים. למרות ש-AITC פחות רעיל מ-BITC, ערכי ה-LC50 שלו נמוכים יותר משמנים אתריים רבים שנבדקו על זחלי יתושים32,73,74,75.
אבקת זרעי המצליבים שלנו לשימוש נגד זחלי יתושים מכילה גלוקוזינולט עיקרי אחד, המהווה מעל 98-99% מכלל הגלוקוזינולטים כפי שנקבע על ידי HPLC. כמויות זעירות של גלוקוזינולטים אחרים זוהו, אך רמותיהם היו פחות מ-0.3% מכלל הגלוקוזינולטים. אבקת זרעי גרגר הנחלים (L. sativum) מכילה גלוקוזינולטים משניים (סיניגרין), אך חלקם הוא 1% מכלל הגלוקוזינולטים, ותכולתם עדיין זניחה (כ-0.4 מ"ג/גרם אבקת זרעים). למרות ש-PG ו-DFP מכילים את אותו גלוקוזינולט עיקרי (מירוזין), הפעילות הקוטלת הזחלים של קמח הזרעים שלהם שונה באופן משמעותי עקב ערכי LC50 שלהם. רעילות משתנה לטחב אבקתי. הופעתם של זחלי Aedes aegypti עשויה להיות תוצאה של הבדלים בפעילות מירוזינאז או ביציבות בין שני סוגי מזון הזרעים. פעילות מירוזינאז ממלאת תפקיד חשוב בזמינות הביולוגית של תוצרי הידרוליזה כגון איזותיוציאנטים בצמחי כרוב זרעים76. דיווחים קודמים של פוקוק ואחרים77 ווילקינסון ואחרים78 הראו כי שינויים בפעילות וביציבות מירוזינאז עשויים להיות קשורים גם לגורמים גנטיים וסביבתיים.
תכולת האיזותיוציאנט הביו-אקטיבית הצפויה חושבה על סמך ערכי LC50 של כל קמח זרעים לאחר 24 ו-72 שעות (טבלה 5) לצורך השוואה עם יישומים כימיים מקבילים. לאחר 24 שעות, האיזותיוציאנטים בקמח הזרעים היו רעילים יותר מהתרכובות הטהורות. ערכי LC50 שחושבו על סמך חלקים למיליון (ppm) של טיפולי זרעים עם איזותיוציאנט היו נמוכים יותר מערכי LC50 עבור יישומי BITC, AITC ו-4-HBITC. צפינו בזחלים צורכים כדורי קמח זרעים (איור 3A). כתוצאה מכך, זחלים עשויים לקבל חשיפה מרוכזת יותר לאיזותיוציאנטים רעילים על ידי בליעת כדורי קמח זרעים. זה היה ניכר ביותר בטיפולי קמח זרעים IG ו-PG בחשיפה של 24 שעות, כאשר ריכוזי LC50 היו נמוכים ב-75% ו-72% מטיפולי AITC ו-4-HBITC טהורים, בהתאמה. טיפולי Ls ו-DFP היו רעילים יותר מאשר איזותיוציאנט טהור, עם ערכי LC50 נמוכים ב-24% ו-41%, בהתאמה. הזחלים בטיפול הביקורת התגלמו בהצלחה (איור 3B), בעוד שרוב הזחלים בטיפול קמח הזרעים לא התגלמו והתפתחות הזחל התעכבה משמעותית (איור 3B,D). ב-Spodopteralitura, איזותיוציאנטים קשורים לעיכוב בגדילה ועיכוב התפתחותי79.
זחלי יתושי Aedes aegypti נחשפו ברציפות לאבקת זרעי Brassica במשך 24-72 שעות. (א) זחלי זרעים מתים עם חלקיקי קמח זרעים בחלקי הפה (מוקפים בעיגול); (ב) טיפול בקרה (dH20 ללא תוספת קמח זרעים) מראה כי הזחלי גדלים כרגיל ומתחילים להתגלם לאחר 72 שעות. (ג, ד) זחלי זרעים שטופלו בקמח זרעים; קמח הזרעים הראה הבדלים בהתפתחות ולא התגלם.
לא חקרנו את מנגנון ההשפעות הרעילות של איזותיוציאנטים על זחלי יתושים. עם זאת, מחקרים קודמים בנמלי אש אדומות (Solenopsis invicta) הראו כי עיכוב של גלוטתיון S-טרנספראז (GST) ואסטראז (EST) הוא המנגנון העיקרי של פעילות ביולוגית של איזותיוציאנט, ו-AITC, אפילו בפעילות נמוכה, יכול גם לעכב את פעילות GST. נמלי אש אדומות מיובאות בריכוזים נמוכים. המינון הוא 0.5 מיקרוגרם/מ"ל80. לעומת זאת, AITC מעכב אצטילכולין אסטראז בחדקוני תירס בוגרים (Sitophilus zeamais)81. יש לבצע מחקרים דומים כדי להבהיר את מנגנון פעילות האיזותיוציאנט בזחלי יתושים.
אנו משתמשים בטיפול DFP מומת בחום כדי לתמוך בהצעה שהידרוליזה של גלוקוזינולטים צמחיים ליצירת איזותיוציאנטים ריאקטיביים משמשת כמנגנון לבקרת זחלי יתושים באמצעות קמח זרעי חרדל. קמח זרעי DFP-HT לא היה רעיל בקצבי היישום שנבדקו. לפארגה ועמיתיו 82 דיווחו כי גלוקוזינולטים רגישים לפירוק בטמפרטורות גבוהות. טיפול בחום צפוי גם לפגל את האנזים מירוזינאז בקמח הזרעים ולמנוע הידרוליזה של גלוקוזינולטים ליצירת איזותיוציאנטים ריאקטיביים. ממצא זה אושר גם על ידי אוקונאדה ועמיתיו 75 שהראו כי מירוזינאז רגיש לטמפרטורה, דבר המראה שפעילות מירוזינאז הושבתה לחלוטין כאשר זרעי חרדל, חרדל שחור ושורש דם נחשפו לטמפרטורות מעל 80°C. מנגנונים אלה עלולים לגרום לאובדן פעילות קוטלי חרקים של קמח זרעי DFP שטופל בחום.
לפיכך, קמח זרעי חרדל ושלושת האיזותיוציאנטים העיקריים שלו רעילים לזחלי יתושים. בהתחשב בהבדלים אלה בין קמח זרעים לטיפולים כימיים, השימוש בקמח זרעים עשוי להיות שיטה יעילה להדברת יתושים. יש צורך לזהות פורמולציות מתאימות ומערכות אספקה ​​יעילות כדי לשפר את היעילות והיציבות של השימוש באבקות זרעים. תוצאותינו מצביעות על השימוש הפוטנציאלי בקמח זרעי חרדל כחלופה לחומרי הדברה סינתטיים. טכנולוגיה זו עשויה להפוך לכלי חדשני לשליטה בווקטורי יתושים. מכיוון שזחלי יתושים משגשגים בסביבות מימיות וגלוקוזינולטים מקמח זרעים מומרים אנזימטית לאיזותיוציאנטים פעילים לאחר הידרציה, השימוש בקמח זרעי חרדל במים שורצי יתושים מציע פוטנציאל משמעותי לשליטה. למרות שפעילותם הקוטלת הזחלים של איזותיוציאנטים משתנה (BITC > AITC > 4-HBITC), יש צורך במחקר נוסף כדי לקבוע האם שילוב קמח זרעים עם גלוקוזינולטים מרובים מגביר באופן סינרגטי את הרעילות. זהו המחקר הראשון המדגים את ההשפעות הקוטליות של קמח זרעים נטול שומן ושלושה איזותיוציאנטים ביו-אקטיביים על יתושים. תוצאות מחקר זה פורצות דרך בכך שהראו כי קמח זרעי כרוב נטול שומן, תוצר לוואי של הפקת שמן מהזרעים, עשוי לשמש כחומר מבטיח להדברת זחלים. מידע זה יכול לסייע בקידום גילוי חומרי הדברה ביולוגיים צמחיים ופיתוחם כקוטלי חרקים ביולוגיים זולים, פרקטיים וידידותיים לסביבה.
מערכי הנתונים שנוצרו עבור מחקר זה והניתוחים שנוצרו כתוצאה מכך זמינים מהמחבר המתאים לפי בקשה סבירה. בסוף המחקר, כל החומרים ששימשו במחקר (חרקים וקמח זרעים) הושמדו.